山羊痘病毒感染过程中ova-miR-34a-5p的动态表达及其靶标鉴定

发布时间：2017-07-18 17:39

  本文关键词：山羊痘病毒感染过程中ova-miR-34a-5p的动态表达及其靶标鉴定

  更多相关文章： ova-miR-34a-5p 山羊痘病毒 mycn

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)分子是一类短小(长度约为22 nt)的内源性非编码小RNA分子,广泛的存在于动植物以及病毒中。该分子可以通过抑制目标蛋白mRNA翻译或促使其降解进行靶标蛋白表达的调控,在多种复杂生物学过程中发挥重要作用。研究表明miRNAs分子在病毒感染过程中发挥重要的生物学功能,可以作为有效控制疾病的靶标。因此,本研究选取在山羊痘病毒感染的羔羊睾丸细胞中差异表达的ova-miR-34a-5p分子,研究其在山羊痘病毒感染过程中的动态表达情况,预测并验证其靶标分子,为阐明miRNAs分子在羊痘病毒感染过程中发挥的作用奠定了基础。本实验选取前期通过下一代高通量测序技术筛选出的在山羊痘病毒感染羔羊睾丸细胞4h时差异表达的ova-miR-34a-5p,利用实时定量荧光PCR(Q-PCR)技术验证山羊痘病毒感染羔羊睾丸细胞Oh、0.5h、4h、10h、24h和48h六个感染时间点的ova-miR-34a-5p的动态表达情况；利用TargetScan数据库、RNA22数据库和miRanda数据库进行ova-miR-34a-5p靶标基因的预测,并通过Gene Onthology(GO)注释及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信号通路富集分析方法对预测靶标基因进行相关生物信息学分析；采用双荧光素酶报告基因检测系统对预测的靶标基因进行验证。主要实验结果如下：(1)与山羊痘病毒感染0h相比,ova-miR-34a-5p的表达水平在感染0.5h、4h和10h时没有明显变化(P0.05),而在感染24h时明显升高(P0.05),之后在感染48h时又有所下降(P0.05),提示它可能与病毒的DNA合成有一定的联系。(2)采用TargetScan数据库、RNA22数据库和miRanda数据库进行靶标分子的预测,对于所得预测数据取交集共计得到599个ova-miR-34a-5p的靶标分子,分子功能主要涉及蛋白质结合,生物学过程主要富集在转录调控、细胞增殖及细胞定位等。综合ova-miR-34a-5p的靶标分子预测结果及其在病毒感染过程中的表达变化,我们选取转录因子mycn进行进一步的靶标分子验证。(3)利用双荧光素酶报告基因检测系统,构建野生型和突变型重组质粒进行靶标基因的验证。结果显示,mycn-WT(野生型)+ova-miR-34a-5p类似物共转染组与mycn-WT(野生型)+阴性共转染对照组相比差异极显著(P0.01),其相对表达量约为对照组的0.65,而mycn-mut(突变型)+ova-miR-34a-5p类似物共转染组与对照组相比差异不显著(P0.05),表明ova-miR-34a-5p可以抑制转录因子mycn的表达。结论：ova-miR-34a-5p的表达量在病毒感染24h时明显升高,其可能通过调节mycn的表达水平影响病毒DNA合成,但其具体机制还需要进一步研究。
【关键词】：ova-miR-34a-5p 山羊痘病毒 mycn
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.654
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词英文对照表10-13
• 第一章 引言13-27
• 1.1 羊痘病毒概述13-15
• 1.2 miRNA的分子特征及在动物中的合成15-18
• 1.3 miRNA在HIV-1病毒感染过程中的作用18-21
• 1.4 miRNA的主要检测方法21-23
• 1.4.1 Northern blotting杂交21
• 1.4.2 miRNA芯片21
• 1.4.3 Q-PCR(real time quantitative PCR)21-22
• 1.4.4 高通量测序22-23
• 1.5 靶基因预测方法23-25
• 1.6 研究目的与意义25-27
• 第二章 羊痘病毒感染过程中ova-miR-34a-5p的动态表达27-38
• 2.1 实验材料27-28
• 2.1.1 主要试剂27
• 2.1.2 主要仪器27-28
• 2.2 实验方法28-32
• 2.2.1 羔羊睾丸(LT)细胞培养28-29
• 2.2.2 LT细胞的接毒与收毒29
• 2.2.3 实时定量PCR(Q-PCR)反应29-32
• 2.3 实验结果32-37
• 2.3.1 提取的样品总RNA质量检测32-35
• 2.3.2 引物质量及内参基因检测35-36
• 2.3.3 ova-miR-34a-5p在病毒感染过程中表达量变化的验证36-37
• 2.4 讨论37-38
• 第三章 mir-34a及其靶标基因的生物信息学分析38-51
• 3.1 实验材料38
• 3.2 实验方法38-39
• 3.2.1 mir-34a序列的获得38-39
• 3.2.2 系统发生分析39
• 3.2.3 靶基因预测39
• 3.2.4 靶基因功能分析39
• 3.3 实验结果与分析39-49
• 3.3.1 mir-34a的序列保守性及在基因组中的定位39-41
• 3.3.2 系统进化树的构建41-42
• 3.3.3 靶基因预测42-45
• 3.3.4 靶基因功能分析45-49
• 3.4 讨论49-51
• 第四章 ova-miR-34a-5p的靶基因mycn的初步鉴定51-66
• 4.1 实验材料51-52
• 4.1.1 细胞、菌种和试剂51-52
• 4.1.2 主要实验器材52
• 4.2 实验方法52-59
• 4.2.1 LT细胞总RNA的提取52
• 4.2.2 mycn 3’UTR序列的克隆52-54
• 4.2.3 双荧光素酶报告基因重组载体的构建54-58
• 4.2.4 双荧光素酶报告基因检测58-59
• 4.2.5 统计学处理59
• 4.3 实验结果与分析59-64
• 4.3.1 总RNA提取质量检测59-60
• 4.3.2 mycn 3'UTR序列扩增结果60-61
• 4.3.3 双荧光素酶报告基因重组载体的构建与鉴定61-62
• 4.3.4 双荧光素酶报告基因检测62-64
• 4.3.5 统计学处理64
• 4.4 讨论64-66
• 第五章 全文结论66-67
• 参考文献67-75
• 致谢75-76
• 个人简介76

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 程振涛;岳筠;徐春志;李永明;许乐仁;文明;周碧君;;山羊痘病毒贵州株的分离与鉴定[J];黑龙江畜牧兽医;2008年03期

2 周碧君;虞天德;阴正兴;何光志;许乐仁;;山羊痘病毒粒子的电子显微镜观察[J];中国预防兽医学报;2006年03期

3 刘棋;黄夏;郭建刚;陈义祥;郑敏;邓朝阳;李华明;邹联斌;;山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究[J];中国预防兽医学报;2006年05期

4 周碧君;岳筠;徐春志;程振涛;;山羊痘病毒的分离与鉴定[J];中国预防兽医学报;2007年09期

5 王安涛;陈创夫;乔军;张辉;张娜;胡圣伟;;靶向山羊痘病毒DNA聚合酶基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选[J];中国细胞生物学学报;2011年05期

6 关会敏;冉雪琴;姬志林;王嘉福;;山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性[J];中国兽医杂志;2012年04期

7 施扬谷;丁明孝;翟中和;徐伟;;牛传染性鼻气管炎病毒与山羊痘病毒在细胞表面释放的研究[J];电子显微学报;1984年03期

8 施扬谷,丁明孝,翟中和,徐伟;传染性牛鼻气管炎病毒和山羊痘病毒从细胞表面释放的研究[J];病毒学报;1985年01期

9 丁明孝;付宏兰;王梅;翟中和;向德林;周青山;;山羊痘病毒形态发生过程的电子显微镜研究[J];微生物学报;1986年01期

10 柴顺莲;;浅议山羊痘的预防和控制[J];科技致富向导;2010年08期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 许乐仁;周碧君;阴正兴;何光志;刘忠伟;;山羊痘病变的超微病理学观察[A];第二届贵州省自然科学优秀学术论文评选获奖论文集（2007年）[C];2007年

2 郭建刚;刘棋;黄夏;邓朝阳;李华明;兰斌;;广西柳江、兴安两县山羊痘调查及诊断[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

3 周碧君;何光志;虞天德;许乐仁;;贵州山羊痘的病原学研究与血清学检测[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年

4 许乐仁;周碧君;阴正兴;;山羊痘病变的超微病理学研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年

5 周碧君;冯元璋;许乐仁;;山羊痘血清学诊断技术研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会论文集[C];2006年

6 郭福宗;;自拟“透疹排毒汤”治疗山羊痘[A];纪念《元亨疗马集》付梓400周年中国畜牧兽医学会中兽医学分会2008年学术年会华东区第十八次中兽医科研协作与学术研讨会暨兽药发展论坛论文集[C];2008年

7 江楠;文明;许乐仁;龙冲冲;陈传盛;;山羊痘病毒感染体外培养的大鼠雪旺氏细胞[A];2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集[C];2012年

8 许乐仁;周碧君;阴正兴;;有髓神经纤维被山羊痘病毒波及的证实[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2010年

9 邱立新;谈志祥;刘道新;张朝阳;鲁杏华;;湖南省部分县市恶性山羊痘的诊断与防治[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

10 许乐仁;周碧君;阴正兴;;有髓神经纤维被山羊痘病毒侵犯的证实[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集（上册）[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前2条

1 邢兰君;波尔山羊痘诊断与防治[N];农民日报;2004年

2 石林县石林镇畜牧兽医服务中心 张红彦;怎样防治黑山羊常见传染病[N];云南科技报;2010年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 海岗;表达FMDV vp1基因和山羊γ-干扰素基因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究[D];中国农业科学院;2008年

2 郑敏;山羊痘病毒基因缺失毒株及DNA疫苗的构建、鉴定和实验免疫[D];吉林大学;2008年

3 张强;表达亚洲1型口蹄疫病毒P1-2A3C基因的山羊痘病毒弱毒株构建及其复制非必需区筛选[D];中国农业科学院;2007年

4 程振涛;山羊痘病毒某些生物学特性及其主要结构蛋白P32基因的研究[D];贵州大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 邓朝阳;广西山羊痘防控研究[D];南京农业大学;2006年

2 高泽乾;山羊痘病毒感染细胞microRNAs的筛选、鉴定及其在早期诊断中的应用初探[D];中国农业科学院;2015年

3 李浩波;表达蓝舌病病毒VP2，，VP5蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原性研究[D];南京农业大学;2010年

4 曹慧慧;山羊痘病毒N1L基因缺失重组毒株的构建及其生物特性研究[D];广西大学;2016年

5 邵忠伟;山羊痘病毒感染过程中ova-miR-34a-5p的动态表达及其靶标鉴定[D];西北民族大学;2016年

6 程松;大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定[D];华南农业大学;2016年

7 蒋柳平;山羊痘诊断与免疫防制技术研究[D];南京农业大学;2006年

8 黄夏;山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究[D];广西大学;2006年

9 赫春杰;庆阳市山羊痘病流行病学调查与防制[D];甘肃农业大学;2004年

10 李有文;山羊痘病毒表达载体的构建[D];石河子大学;2007年

本文编号：558975