猪源抗菌肽Cecropin P1的原核表达及抑菌活性检测

发布时间：2017-07-18 20:12

  本文关键词：猪源抗菌肽Cecropin P1的原核表达及抑菌活性检测

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【摘要】：随着抗生素的使用,药物残留和菌株耐药性等问题日益严重,寻找抗生素替代品己迫在眉睫。抗菌肽以其独特的抗菌机制及不易产生耐药性等优点,在替代传统抗生素、减少菌株耐药性等方面显示出广阔的应用前景。天蚕素(Cecropins)是首先由Huhmark等人在惜古比天蚕中发现的抗菌肽,目前已有30多种天蚕素被报道,其中Cecropin P1 (CP1)是Lee等首先从猪小肠分离得到的抗菌肽,由31个氨基酸组成,分子量为3339 Da,具有广谱抗菌活性。但由于CP1的天然产量有限,分离纯化困难且成本较高,极大限制了它的临床应用,因此通过基因工程技术生产CP1具有重要的意义。为探索大量获取CP1的基因工程方法。本研究根据CP1成熟肽的氨基酸序列,利用大肠杆菌密码子偏爱性特点,采用搭桥PCR技术,设计合成CP1目的基因,并构建重组克隆质粒pMD19-T-CP1.利用限制性内切酶EcoRI和XbaI分别对原核表达载体pCold TF和重组克隆质粒pMD19-T-CP1双酶切,并在T4 DNA连接酶的作用下构建重组表达质粒pCold TF-CP1。将pCold TF-CP1转化BL21(DE3)感受态细胞,所得阳性转化菌株(重组质粒工程菌)经IPTG诱导表达融合蛋白(rCP1)。rCP1经Ni-NTA柱纯化及超滤除盐浓缩后,由肠激酶切割释放CP1。最后采用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法对CP1抑菌活性进行检测。主要研究结果如下：(1)通过搭桥PCR技术成功合成CP1目的基因,并构建了重组克隆质粒pMD19-T-CP1。(2)成功构建了重组表达质粒pCold TF-CP1,并转化BL21(DE3)感受态细胞得到重组质粒工程菌。(3)重组质粒工程菌经IPTG诱导表达出可溶性融合蛋白,其占总可溶性蛋白的36%以上；融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后纯度约为80%；通过超微量分光光度计(NANODROP 2000)测定超滤后的浓缩蛋白浓度为3.5 mg/mL：经计算每升菌体培养物可获得约55 mg融合蛋白。(4)通过与标准品比较,确定2.8 mg/mL rCP1经肠激酶切割释放出(0.144±0.04)mg/mL CP1。抗菌试验结果表明,CP1对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门氏菌有良好的抗菌活性。本研究利用原核表达系统成功获得了rCP1, rCP1经肠激酶切割后释放出具有良好抗肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门氏菌活性的CP1,为建立基因工程菌规模化生产抗菌肽相关研究奠定了基础和提供了科学参考。
【关键词】：抗菌肽 Cecropin Pl 原核表达 肠激酶 抗菌活性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.797;Q78
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 缩略词表8-13
• 第一部分 文献综述13-23
• 1 抗菌肽的研究进展13-21
• 1.1 抗菌肽的概述13-21
• 1.1.1 抗菌肽的分类14
• 1.1.2 抗菌肽的理化性质14-16
• 1.1.3 抗菌肽的作用机理16-18
• 1.1.4 抗菌肽的基因工程研究18-19
• 1.1.5 抗菌肽在畜牧业中的应用19-20
• 1.1.6 面临的问题20-21
• 2 猪源抗菌肽Cecropin P121-23
• 2.1 Cecropin P1的结构21
• 2.2 Cecropin P1的抗菌机理21-23
• 第二部分 试验研究23-71
• 第一章 抗菌肽Cecropin P1目的基因的人工合成23-34
• 1 试验材料23-25
• 1.1 菌株和载体23
• 1.2 主要试剂23-24
• 1.3 溶液配置24
• 1.4 主要仪器24-25
• 2 试验方法25-31
• 2.1 CP1目的基因设计25-26
• 2.2 引物设计26
• 2.3 CP1目的基因的人工合成26-27
• 2.3.1 初级延伸反应26
• 2.3.2 次级延伸反应26-27
• 2.4 目的基因的克隆及鉴定27-31
• 2.4.1 CP1目的基因的回收27
• 2.4.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备27-28
• 2.4.3 CP1目的基因与载体质粒的连接28-29
• 2.4.4 重组质粒转化至宿主菌DH5α29
• 2.4.5 重组质粒的鉴定29-31
• 3 试验结果31-32
• 3.1 CP1目的基因的人工合成31
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定31-32
• 3.3 测序鉴定32
• 4 讨论32-34
• 第二章 重组表达质粒pCold TF-CP1的构建34-44
• 1 试验材料34-36
• 1.1 菌株和载体34
• 1.2 主要试剂34-35
• 1.3 溶液配制35
• 1.4 主要仪器35-36
• 2 试验方法36-41
• 2.1 CP1目的基因的制备36-37
• 2.2 原核表达载体pCold TF基因片段的制备37
• 2.3 CP1目的基因与表达载体的连接37-38
• 2.4 重组质粒转化至DH5α38
• 2.5 重组质粒的鉴定38-41
• 2.5.1 重组质粒抽提38-39
• 2.5.2 菌落PCR鉴定39-40
• 2.5.3 重组质粒的酶切鉴定40-41
• 2.5.4 重组质粒的测序鉴定41
• 3 试验结果41-42
• 3.1 菌落PCR鉴定41-42
• 3.2 酶切鉴定结果42
• 3.3 测序鉴定结果42
• 4 讨论42-44
• 第三章 重组质粒工程菌的诱导表达44-57
• 1 试验材料44-47
• 1.1 菌株和质粒44
• 1.2 主要试剂44-45
• 1.3 溶液配制45-46
• 1.4 主要仪器46-47
• 2 试验方法47-51
• 2.1 重组质粒工程菌的诱导表达47-48
• 2.1.1 重组质粒工程菌的制备47
• 2.2.2 重组表达工程菌的初步表达47-48
• 2.2.3 SDS-PAGE电泳检测48
• 2.2 重组表达蛋白的可溶性检测48-49
• 2.3 诱导表达的时间选择49
• 2.4 诱导剂的浓度选择49
• 2.5 重组表达蛋白的免疫印迹分析(Western-blot)49-51
• 2.5.1 蛋白质样品制备49
• 2.5.2 SDS-PAGE电泳49-50
• 2.5.3 Western-blot杂交检测50-51
• 3 试验结果51-55
• 3.1 重组质粒工程菌的初步表达51-52
• 3.2 重组表达蛋白的可溶性鉴定52
• 3.3 诱导表达时间的优化52-53
• 3.4 IPTG工作浓度优化53-54
• 3.5 重组表达蛋白免疫印迹分析54-55
• 4 讨论55-57
• 第四章 抗菌肽CP1的释放及抑菌活性检测57-71
• 1 试验材料57-59
• 1.1 菌株57
• 1.2 主要试剂57-58
• 1.3 溶液配制58
• 1.4 主要仪器58-59
• 2 试验方法59-61
• 2.1 融合蛋白的处理59-60
• 2.1.1 融合蛋白纯化59-60
• 2.1.2 融合蛋白除盐浓缩60
• 2.2 融合蛋白rCP1的切割60-61
• 2.3 Tricine-SDS-PAGE61
• 2.4 酶切产物的活性检测61
• 2.5 酶切产物的分析61
• 3 试验结果61-69
• 3.1 融合蛋白rCP1的纯化61-62
• 3.2 融合蛋白的浓缩62-63
• 3.3 融合蛋白的切割63-64
• 3.4 酶切产物的活性检测64-66
• 3.5 酶切产物的分析66-69
• 4 讨论69-71
• 总结71-72
• 参考文献72-79
• 致谢79-80
• 攻读学位期间发表的学术论文80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 许国洋;付利芝;杨金龙;曹国文;张素辉;邱进杰;潘康成;;Gal-13成熟肽基因在毕赤酵母中的表达与抑菌活性分析[J];中国兽医学报;2015年08期

2 刘娃;纪森林;宋玉竹;;细菌对抗菌肽的耐受机制[J];生命科学;2013年10期

3 许文杉;冯兴军;李晓冲;邢丽维;柳迪;;鸡源抗菌肽Fowlicidin-2在大肠杆菌中的重组表达及其生物学活性鉴定[J];微生物学通报;2013年05期

4 仇妍虹;李鹏;李斐;郑其升;曹瑞兵;周斌;陈德胜;陈溥言;;重组家蝇抗菌肽Des-HF在酵母中的表达及对金黄色葡萄球菌的抗菌活性[J];南京农业大学学报;2009年01期

5 韩雪清;林祥梅;侯义宏;吴绍强;刘建;梅琳;贾广乐;杨泽晓;;禽流感病毒分型基因芯片的研制[J];微生物学报;2008年09期

6 马晓艳;马亚珍;苏贵成;;新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)对奶牛乳房炎病原的体外抑菌效果观察[J];新疆畜牧业;2008年02期

7 陈晓生;张辉华;周庆国;朱锦兰;;抗菌肽对肉鸭雏鸭期肠道主要微生物菌落的影响[J];兽药与饲料添加剂;2006年04期

8 马卫明;佘锐萍;胡艳欣;靳红;彭芳珍;;猪小肠抗菌肽对雏鸡的促生长作用及其机理初探[J];中国农业科学;2006年08期

9 梁永利;;天然抗菌肽的来源及分类[J];安徽农业科学;2006年18期

10 马卫明,佘锐萍,靳红,彭芳珍,胡艳欣;猪小肠抗菌肽的抗菌作用研究[J];中国兽医杂志;2005年01期

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本文编号：559570