p53在PCV2诱导细胞周期阻滞中的调控作用

发布时间：2017-07-19 14:03

  本文关键词：p53在PCV2诱导细胞周期阻滞中的调控作用

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【摘要】：猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科、圆环病毒属,为无囊膜的单链环状DNA病毒,是引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征为主要特征的猪圆环病毒病的主要病原。PCV2感染宿主细胞后,常会影响宿主细胞周期和诱导部分宿主细胞凋亡。作为细胞内重要的调控基因,p53在上述过程中可能发挥着重要的调控作用,但在PCV2感染宿主细胞过程中,p53具体通过什么途径对细胞周期进行调控,目前还不清楚。本试验以猪肾源性PK-15细胞为模式细胞,运用靶向于猪p53基因的CRISPR-Cas9慢病毒系统感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞,筛选获得p53基因敲除的PK-15细胞,以不同病毒滴度的PCV2感染野生型和p53基因敲除的PK-15细胞,通过流式细胞术、细胞基因组测序和western blotting等方法检测p53基因敲除对PCV2感染细胞的细胞周期和周期调控分子的影响。研究取得如下实验结果:1.利用CRISPR-Cas9基因编辑系统成功构建了两株p53基因修饰细胞。在靶向于p53基因148位点构建的p53基因敲除的细胞中,p53基因的225碱基位点处插入一个碱基A,使得p53蛋白第47位的丝氨酸变成丙氨酸,并导致其在第54位移码终止;而在靶向于p53基因813位点构建的p53基因敲除的细胞中,p53基因的561、562和564碱基位点处分别缺失碱基C、碱基A和碱基G,导致突变。即靶向于148位点构建的PK-15细胞为p53基因敲除PK-15细胞,而靶向于813位点构建的PK-15细胞为p53基因突变PK-15细胞。Western blotting检测结果显示,靶向于p53基因148位点构建的敲除细胞检测不到p53蛋白的表达,而靶向于p53基因813位点构建的敲除细胞,其p53蛋白表达量与野生型PK-15细胞的p53表达量相比下降了20%左右。2.PCV2感染同步化和非同步化的PK-15细胞后,均可诱导细胞周期阻滞在S期,PCV2诱导的S期阻滞依赖于其自身的复制,同时大量细胞停留在S期显著地促进了病毒的复制。PCV2感染上调p53和p21的蛋白表达,显著降低CDK2和Cyclin A的表达,显著提高Cyclin E的表达。3.PCV2分别感染野生型PK-15细胞,p53敲除的PK-15(148PK-15p53-/-)细胞和p53突变的PK-15(813PK-15p53m/m)细胞,细胞周期检测显示,在野生型PK-15细胞中,PCV2感染组S期细胞的数目显著增多(p0.05),约为对照感染组的1.3倍;在148PK-15p53-/-细胞中,PCV2感染组和模拟感染组间S期细胞群体比例没有显著差异;在813PK-15p53m/m细胞中,PCV2感染组S期细胞群体比例轻度增加;PCV2在野生型PK-15细胞中以一种缓慢增殖的方式进行复制;在813PK-15p53m/m细胞中的病毒拷贝数和野生型PK-15细胞相比,差异并不显著;而PCV2感染148PK-15p53-/-细胞24 h后,病毒拷贝数显著低于野生型PK-15细胞(p0.05);PCV2感染148PK-15p53-/-细胞后,其下游因子p21蛋白未被检测到,Cyclin A、CDK2和Cyclin E的表达量均维持在一个相对稳定的水平,并没有在PCV2感染后减少或者增多。而PCV2感染813PK-15p53m/m细胞后,其下游因子p21蛋白表达被上调,Cyclin A和CDK2蛋白表达量减少,但是与野生型细胞相比减少的程度较低。综合以上结果,本研究工作说明PCV2感染PK-15细胞后,通过上调p53和p21的蛋白表达,显著降低CDK2和Cyclin A的表达,显著提高Cyclin E的表达,促进细胞周期由G1/S监测点向S期过渡,并阻滞细胞通过G2/M监测点,进而诱导细胞周期阻滞在S期,为病毒自身的复制提供有利条件,而p53基因敲除可通过抑制PCV2诱导的p21表达、Cyclin A、CDK2减少和Cyclin E增加,进而阻止S期细胞增多,抑制病毒自身的复制。
【关键词】：猪圆环病毒2型 p53基因敲除 病毒感染 细胞周期阻滞
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-14
• 文献综述14-21
• 第一章 动物病毒感染诱导细胞周期阻滞研究进展14-21
• 1.1 细胞周期概述14-15
• 1.1.1 细胞间期14
• 1.1.2 细胞分裂期14-15
• 1.2 细胞周期调控15-16
• 1.2.1 细胞周期蛋白(Cyclin)15
• 1.2.2 细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)15-16
• 1.2.3 细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子(CKI)16
• 1.2.4 细胞周期监测点16
• 1.3 病毒感染与细胞周期16-17
• 1.3.1 病毒感染对细胞周期的影响及相应的调控机制16-17
• 1.3.2 细胞周期的变化对病毒复制的影响17
• 1.4 p53在细胞周期和病毒感染中的调控作用17-19
• 1.4.1 p53分子简介17-18
• 1.4.2 p53在细胞周期中的调控作用18
• 1.4.3 p53在病毒感染中的调控作用18-19
• 1.5 PCV2感染对细胞周期的影响19
• 1.5.1 PCV2病毒简介19
• 1.5.2 PCV2感染对细胞周期的影响19
• 1.6 本研究的目的与意义19-21
• 试验研究21-44
• 第二章 p53基因敲除细胞的构建及鉴定21-32
• 2.1 试剂材料21-22
• 2.1.1 主要试剂21
• 2.1.2 主要仪器21
• 2.1.3 主要试剂的配制21-22
• 2.2 方法22-28
• 2.2.1 重组目的质粒的构建22-24
• 2.2.2 慢病毒包装24
• 2.2.3 慢病毒滴度测定24-26
• 2.2.4 确定嘌呤霉素筛选的最适浓度26
• 2.2.5 筛选稳定感染的阳性细胞26
• 2.2.6 Western Blotting检测26-27
• 2.2.7 细胞基因组测序法鉴定27-28
• 2.3 结果与分析28-30
• 2.3.1 p53基因敲除位点的确定28
• 2.3.2 双酶切鉴定28-29
• 2.3.3 Western blotting检测构建细胞的p53基因敲除情况29
• 2.3.4 细胞基因组测序29-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-32
• 第三章 PCV2感染对细胞周期的影响32-39
• 3.1 试剂材料32
• 3.1.1 主要试剂32
• 3.1.2 主要仪器32
• 3.1.3 试验溶液的配制32
• 3.2 方法32-33
• 3.2.1 细胞同步化处理32-33
• 3.2.2 流式细胞术测定细胞周期33
• 3.2.3 病毒的绝对定量33
• 3.2.4 Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达33
• 3.3 结果与分析33-37
• 3.3.1 PCV2感染对非同步化PK-15细胞周期的影响33-34
• 3.3.2 PCV2感染对同步化PK-15细胞周期的影响34-35
• 3.3.3 病毒的绝对定量35-36
• 3.3.4 PCV2感染对细胞周期相关蛋白的影响36-37
• 3.3.5 细胞各时期PCV2-Cap蛋白的表达情况37
• 3.4 讨论37-38
• 3.5 小结38-39
• 第四章 p53在PCV2诱导细胞周期阻滞和其自身复制中的作用39-44
• 4.1 试剂材料39
• 4.1.1 主要试剂39
• 4.1.2 主要仪器39
• 4.1.3 主要试剂的配制39
• 4.2 方法39
• 4.2.1 流式细胞术检测细胞周期39
• 4.2.2 病毒的绝对定量39
• 4.2.3 Western blotting检测细胞周期相关蛋白39
• 4.3 结果与分析39-42
• 4.3.1 p53基因敲除抑制PCV2诱导的S期细胞阻滞39-41
• 4.3.2 p53基因敲除抑制PCV2在PK-15细胞内的复制41
• 4.3.3 p53敲除对PCV2感染细胞周期蛋白的影响41-42
• 4.3.4 p53基因敲除抑制PCV2-Cap蛋白的表达42
• 4.4 讨论42-43
• 4.5 小结43-44
• 结论与创新点44-45
• 参考文献45-49
• 主要缩略词和中英文对照表（Abbreviation Index）49-51
• 致谢51-52
• 作者简介52

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本文编号：563209