miR-425对3T3-L1细胞分化的抑制作用研究

发布时间：2017-07-19 14:26

  本文关键词：miR-425对3T3-L1细胞分化的抑制作用研究

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【摘要】：近年来,大量的研究表明,miRNA在脂肪细胞分化过程中发挥着重要的作用,miRNA通过靶定与脂肪细胞分化相关的基因来调控脂肪细胞分化。对miRNA进行序列保守性分析、靶基因预测和功能分析,从而选择miR-425-5p为研究对象。本试验采用双荧光素酶报告基因检测、实时定量PCR(Q-PCR)、免疫印迹(Western blot)等方法对miR-425-5p的作用和功能进行研究。主要的研究结果如下:(1)经miRBase网站对多种物种的miR-425序列对比发现,包括猪在内的多种哺乳动物的miR-425-5p的成熟序列保守性很高,只有少许碱基不同,种子序列是完全相同的,保守性也很高。(2)通过实时定量PCR技术检测miR-425-5p在5月龄大白猪心、肝、脾等多个组织中的表达量,结果显示:miR-425-5p在大白猪中的脂肪组织中的表达量最高,并且在所有脂肪组织中在腹脂中的表达量最高。(3)在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中,miR-425-5p的表达量先下降后上升。转染miR-425-5p mimics和NC,miR-425-5p inhibitor和inhibitor NC到3T3-L1细胞,诱导细胞分化8天,PPARγ、aP2和C/EBPα表达量明显下调,油红O染色也表明miR-425-5p减少脂滴的积累。另外,3T3-L1细胞试验组中,miR-425-5p明显降低细胞中甘油三酯的含量。(4)根据miR-425-5p与靶基因的3’UTR相对应的结合序列,构建了野生型和突变型双荧光素酶报告载体pmirGLO载体,并将这俩种质粒分别于miR-425-5p mimics以及NC共转染到BHK-21细胞中,检测荧光活性。结果显示,miR-425-5p能识别并结合Zfp423的3’UTR对应序列。(5)在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中,Zfp423的表达量先上升后下降的。转染miR-425-5p mimics和NC,miR-425-5p inhibitor和inhibitor NC到3T3-L1细胞并诱导分化6天。实时定量结果显示miR-425-5p在转染mimics后表达量明显比NC组高,在转染Inhibitor后表达量明显比Inhibitor NC组低,但是在Zfp423的mRNA水平上实验组和对照组没有明显差异。Western blot结果显示miR-425-5p调控Zfp423转录后水平。以上结果表明,miR-425-5p抑制Zfp423的翻译水平,从而抑制脂肪细胞分化过程。
【关键词】：脂肪细胞分化 miR-425 Zfp423 PPARγ C/EBPα
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 中英文缩写对照表12-13
• 第一章 文献综述13-24
• 1 引言13
• 2 脂肪概述13-17
• 2.1 脂肪组织的分类13-14
• 2.1.1 白色脂肪组织13-14
• 2.1.2 棕色脂肪组织14
• 2.2 脂肪组织的生成14-15
• 2.3 脂肪细胞分化的转录调控15-17
• 2.3.1 PPARγ15-16
• 2.3.2 C/EBPα16-17
• 3 microRNA及其对脂肪细胞分化的调控17-21
• 3.1 microRNA的生物合成和作用机制17-18
• 3.2 miRNA对脂肪细胞分化的调控18-21
• 3.2.1 miRNA促进脂肪细胞分化19-20
• 3.2.2 miRNA抑制脂肪细胞分化20-21
• 4 miR-425 可能是调控脂肪细胞分化的重要候选miRNA21-23
• 4.1 Zfp423基因与脂肪生成的相关研究21-23
• 4.2 miR-425 的研究23
• 5 研究目的和意义23-24
• 第二章 材料与方法24-42
• 2.1 载体和菌株24
• 2.2 主要试剂和仪器24-25
• 2.3 主要溶液的配制25-26
• 2.4 细胞培养及诱导分化26-27
• 2.4.1 细胞的复苏26
• 2.4.2 细胞的常规培养26
• 2.4.3 细胞冻存26-27
• 2.4.4 3T3-L1细胞的诱导分化27
• 2.5 细胞转染及双荧光素酶活性的测定27-28
• 2.5.1 细胞的转染27
• 2.5.2 双荧光素酶相对活性的检测27-28
• 2.5.2.1 细胞裂解27-28
• 2.6 细胞总RNA的提取28-29
• 2.7 Q-PCR分析29-32
• 2.7.1 miRNA的定量分析29-30
• 2.7.2 基因的定量分析30-32
• 2.8 油红O染色32
• 2.9 甘油三酯和游离脂肪酸含量的测定32-33
• 2.10 靶基因预测以及预测靶基因 3’UTR双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建33-39
• 2.10.1 靶基因预测33
• 2.10.2 预测靶基因 3’UTR双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建33-39
• 2.11 靶基因的鉴定39
• 2.12 Western blotting分析39-41
• 2.12.1 蛋白提取39
• 2.12.2 SDS-PAGE电泳39-40
• 2.12.3 转膜40
• 2.12.4 抗原抗体免疫反应40-41
• 2.12.5 抗体41
• 2.13 主要数据库及分析软件41
• 2.14 统计学分析41-42
• 第三章 结果与分析42-51
• 3.1 miR4255p序列保守性分析42
• 3.2 miR4255p的组织表达谱分析42-43
• 3.3 miR4255p的细胞表达谱分析43-44
• 3.4 miR4255p抑制小鼠 3T3-L1前脂肪细胞的分化44-47
• 3.5 miR4255p靶基因的鉴定47-49
• 3.6 miR4255p通过靶定Zfp423抑制脂肪细胞分化49-51
• 第四章 讨论51-54
• 4.1 miR4255p的靶基因预测51-52
• 4.2 miR4255p通过调控Zfp423的表达来抑制脂肪细胞分化52-53
• 4.3 miR4255p抑制脂肪细胞分化的意义53-54
• 第五章 结论54-55
• 5.1 本研究的主要成果54
• 5.2 本实验不足之处及下一步计划54-55
• 参考文献55-63
• 附录63-64
• 致谢64

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