布鲁菌感染RAW264.7细胞的内质网应激与免疫活性研究

发布时间：2017-07-25 21:22

  本文关键词：布鲁菌感染RAW264.7细胞的内质网应激与免疫活性研究

  更多相关文章： 布鲁菌S2株 RAW264.7细胞 内质网应激 GRP78 CHOP 免疫因子

【摘要】：布鲁菌(Brucella)是兼性胞内寄生菌,能感染多种动物和人,引起重要的人兽共患病布鲁菌病(brucellosis),不仅对畜牧业发展造成巨大损失,还严重危害人类健康。布鲁菌主要寄生于巨噬细胞和胚胎滋养层细胞,并且能够在宿主细胞内完成其生存周期,从而逃逸宿主机体的免疫清除效应而保全自身存活定植与增殖。研究发现,布鲁菌可以抑制宿主细胞凋亡,而内质网应激与细胞凋亡的调节密切相关。本研究利用布鲁菌S2株(B.suis.S2)感染RAW264.7细胞建立体外感染模型并确定细胞发生凋亡的最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)。利用RAW264.7细胞建立感染模型,通过检测内质网应激的标志性因子GRP78和CHOP的表达变化,分析布鲁菌感染与内质网应激的关系;同时,检测细胞上清液中免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化,探究布鲁菌感染对巨噬细胞免疫活性的影响。试验结果如下:1.B.suis.S2感染RAW264.7细胞,MOI分别取5∶1、10∶1、50∶1、100∶1,感染24 h后,收取细胞进行Hoechst33342/PI染色。MOI为100∶1时,细胞出现明显的凋亡。选取MOI 100∶1感染RAW264.7细胞,分别于感染0 h、6 h、12 h、24 h和48 h,收取细胞进行AO/EB染色,结果显示感染24 h细胞凋亡开始增多,48 h细胞出现坏死。最终确定最佳感染复数MOI 100∶1,感染时间24 h。2.通过荧光定量PCR和Western blot测定GRP78和CHOP的变化,在感染0 h~48 h内,GRP78 mRNA和蛋白的表达量均升高,而CHOP的表达没有显著变化(P0.05)。结果表明布鲁菌感染可诱导细胞内质网应激反应,但内质网应激介导的细胞凋亡通路并没有被激活。提示布鲁菌能够抑制或者延迟宿主细胞凋亡,利于细菌存活与增殖。3.通过荧光定量PCR和ELISA分别检测IL-1β、IL-6、TNF-α的变化,在感染0 h~6 h,感染细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量都显著高于对照组(P0.05),而感染细胞IL-1β和IL-6的表达量随着感染时间的增加出现明显降低趋势,对照组变化不明显(P0.05)。结果表明感染初期,布鲁菌能够激发巨噬细胞的免疫活性,随着感染的发展,细胞内细菌大量增殖,细胞的免疫活性随之下降。
【关键词】：布鲁菌S2株 RAW264.7细胞 内质网应激 GRP78 CHOP 免疫因子
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.12
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 文献综述11-20
• 第一章 布鲁菌的研究进展11-20
• 1.1 布鲁菌的生物学特性11-12
• 1.2 布鲁菌致病性相关因素12-15
• 1.2.1 脂多糖12-13
• 1.2.2 外膜蛋白13-14
• 1.2.3 IV型分泌系统14-15
• 1.2.4 二元调控系统15
• 1.3 布鲁菌的免疫逃避15-16
• 1.3.1 布鲁菌与巨噬细胞15-16
• 1.3.2 机体对布鲁菌的免疫应答16
• 1.4 布鲁菌与内质网应激16-19
• 1.5 本研究目的意义及主要内容19-20
• 试验研究20-49
• 第二章 布鲁菌感染RAW264.7 细胞模型建立20-30
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 菌株与细胞系20
• 2.1.2 主要试剂20
• 2.1.3 实验仪器20-21
• 2.2 方法21-24
• 2.2.1 RAW264.7 细胞培养21-22
• 2.2.2 布鲁菌菌株的培养22-23
• 2.2.3 布鲁菌感染复数的选择23
• 2.2.4 RAW264.7 细胞内布鲁菌的检测23-24
• 2.3 结果24-27
• 2.3.1 RAW264.7 细胞培养24
• 2.3.2 布鲁菌形态及染色特征24-25
• 2.3.3 布鲁菌胞内菌落计数25
• 2.3.4 布鲁菌感染复数的选择25-27
• 2.4 讨论27-29
• 2.5 小结29-30
• 第三章 布鲁菌感染对RAW264.7 细胞内质网应激的影响30-39
• 3.1 材料30-32
• 3.1.1 菌株与细胞系30
• 3.1.2 主要试剂30-31
• 3.1.3 实验仪器31-32
• 3.2 方法32-35
• 3.2.1 荧光定量PCR检测GRP78和CHOP表达32-33
• 3.2.2 Western Blot检测GRP78和CHOP表达33-35
• 3.3 结果35-37
• 3.3.1 GRP78和CHOP在mRNA水平的表达35-36
• 3.3.2 GRP78和CHOP在蛋白水平的表达36-37
• 3.4 讨论37-38
• 3.5 小结38-39
• 第四章 布鲁菌感染RAW264.7 细胞免疫活性研究39-49
• 4.1 材料39-40
• 4.1.1 菌株与细胞系39
• 4.1.2 主要试剂39
• 4.1.3 实验仪器39-40
• 4.2 方法40-42
• 4.2.1 荧光定量PCR检测免疫因子表达40-41
• 4.2.2 ELISA检测免疫因子表达41-42
• 4.3 结果42-47
• 4.3.1 TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达变化42-45
• 4.3.2 ELISA测定TNF-α、IL-1β、IL-6 的分泌45-47
• 4.4 讨论47-48
• 4.5 小结48-49
• 结论49-50
• 参考文献50-58
• 附录58-59
• 附录一：试剂配制58-59
• 缩略词59-62
• 致谢62-64
• 作者简介64

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