单增李斯特菌双组分系统应答调节蛋白基因RS11565的功能研究

发布时间：2017-07-26 12:32

  本文关键词：单增李斯特菌双组分系统应答调节蛋白基因RS11565的功能研究

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【摘要】：单增李斯特菌(Listeria monocytogenges,Lm)是导致人兽共患病-李斯特菌病(Listeriosis)的食源性病原菌。Lm的易感者为免疫缺陷和免疫力低下者。李斯特菌病虽患病率不高,但患病死亡率可达20%~30%。近几年,我国不断有人和动物李斯特菌病病例的报道,Lm对我国人民健康的威胁和畜牧业发展的影响不容小觑。因此,重视Lm致病机制的研究势在必行。双组分信号转导系统(TCS)普遍存在于细菌中,与病原菌的毒力因子表达密切相关。因此,研究Lm的TCS是探究Lm致病机理的重要方面。本研究应用生物信息学方法对Lm的食品分离株LM201的TCS进行了统计和分析,发现一对TCS--RS11570/RS11565的功能未知。本研究构建了调节蛋白基因RS11565的突变菌株,考察了突变株的部分生物学特性,初步探明了该TCS与Lm毒力的相关性,以期给Lm致病机理补充新的信息。研究工作及其结果如下。1.LM201基因组TCSs的分析根据LM201的基因组信息,应用生物信息学方法发现,LM201的TCS数目为14对HK/RR和2个孤儿RR;HKs包含11种组成结构,RRs分属于7个亚家族;HKs和RRs的进化关系一致;功能预测发现LM201中存在1对功能未知TCS--RS11570/RS11565。2.RS11565基因缺失突变菌株S4070的构建以LM201基因组为模板,扩增RS11565上下游同源臂,构建了重组自杀质粒p3007,电转p3007入LM201,筛选发生同源重组的转化子,获得突变菌株S4070。3.突变菌株S4070的生物学特性对S4070生长曲线和主要生化特性进行了测定,发现S4070与亲本株LM201的生长速率和主要生化特性一致。用线虫C.elegans N2和小鼠分别对S4070进行了毒力测定。线虫试验结果:LM201组和S4070组线虫的平均寿命均为12.0 d,E.coli OP50对照组线虫的平均寿命为15.5 d,LM201组和S4070组线虫的寿命显著短于对照组,但LM201组与S4070组间差异不显著。小鼠试验结果:LM201的LD50为1.55×106 CFU,S4070的为4.37×105 CFU,统计分析表明二者的LD50差异不显著。对S4070进行了小鼠肝脏和脾脏组织载菌量测定。结果显示:72h时,肝脏中LM201载菌量为2.76×107~3.64×107 CFU/g,S4070载菌量为1.95×108~3.61×108CFU/g,其显著高于LM201组;脾脏中S4070与LM201载菌量无显著性差异。用Caco-2细胞对S4070进行了黏附和侵袭试验,结果显示:与LM201相比,S4070对Caco-2的黏附能力显著降低,但对Caco-2的侵袭能力无显著性差异。用RAW264.7细胞对S4070进行了吞噬试验,结果发现S4070抗RAW264.7的吞噬能力与LM201相比无显著性差异。
【关键词】：单增李斯特菌 双组分信号转导系统 RS11565 基因缺失 生物学特性
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略语表(Abbreviation)10-11
• 1 文献综述11-20
• 1.1 单增李斯特菌简介11-13
• 1.1.1 基本特性11
• 1.1.2 流行病学特征11-12
• 1.1.3 临床症状12-13
• 1.1.4 治疗与防治13
• 1.2 单增李斯特菌毒力因子与侵染细胞机制13-15
• 1.2.1 毒力因子13-14
• 1.2.2 侵染细胞机制14-15
• 1.3 单增李斯特菌双组分信号转导系统15-18
• 1.3.1 双组分信号转导系统的基本特性15-16
• 1.3.2 双组分信号转导系统的调控机制16-17
• 1.3.3 双组分信号转导系统的网络调控17
• 1.3.4 单增李斯特菌双组分信号转导系统的研究现状17-18
• 1.4 生物信息学在细菌双组分系统研究中的应用18-19
• 1.5 秀丽隐杆线虫在Lm致病性和毒力研究中的应用19-20
• 2 研究目的和意义20-21
• 3 材料与方法21-34
• 3.1 材料21-25
• 3.1.1 菌种和质粒21
• 3.1.2 实验动物和细胞系21-22
• 3.1.3 主要器材22
• 3.1.4 主要试剂22-23
• 3.1.5 主要溶液配制23-24
• 3.1.6 生物信息学分析软件24
• 3.1.7 引物24-25
• 3.2 方法25-34
• 3.2.1 LM201双组分信号转导系统预测25
• 3.2.2 LM201的RS11565基因左右臂的克隆与鉴定25-27
• 3.2.3 重组自杀性质粒的构建27-29
• 3.2.4 Δ RS11565突变菌株的构建29-31
• 3.2.5 Δ RS11565突变菌株生长曲线的测定31
• 3.2.6 Δ RS11565突变菌株生化特性的鉴定31
• 3.2.7 Δ RS11565突变菌株对C. elegans N2的毒力测定31
• 3.2.8 Δ RS11565突变菌株对小鼠的毒力测定31-32
• 3.2.9 Δ RS11565突变菌株对Caco-2 细胞的黏附和侵袭实验32-33
• 3.2.10 RAW264.7 细胞对Δ RS11565突变菌株的吞噬实验33-34
• 4 结果与分析34-56
• 4.1 LM201中TCS的生物信息学分析34-44
• 4.1.1 LM201中TCSs的统计34-36
• 4.1.2 LM201中组氨酸激酶HK的系统进化树的构建与分析36-37
• 4.1.3 LM201中应答调节蛋白RR的系统进化树的构建与分析37-38
• 4.1.4 LM201中组氨酸激酶HK的结构域组成与分类38-41
• 4.1.5 LM201中应答调节蛋白RR的结构域组成与分类41-42
• 4.1.6 LM201的TCSs的功能预测42-44
• 4.2 LM201中RS11570/RS11565基因结构特征分析44-48
• 4.3 Δ RS11565突变菌株的构建48-50
• 4.3.1 同源臂的克隆和氯霉素抗性基因(cat)的扩增48
• 4.3.2 同源臂与cat基因片段的连接48-49
• 4.3.3 重组自杀质粒p3007的构建与鉴定49
• 4.3.4 Δ RS11565突变菌株的鉴定49-50
• 4.4 Δ RS11565突变菌株生长曲线的测定50-51
• 4.5 Δ RS11565突变菌株生化特性的鉴定51
• 4.6 Δ RS11565突变菌株对C. elegans N2的毒力测定51-53
• 4.7 Δ RS11565突变菌株对小鼠的毒力测定53-54
• 4.7.1 小鼠半数致死量(LD50)的测定53
• 4.7.2 组织载菌量的测定53-54
• 4.8 Δ RS11565突变菌株对Caco-2 细胞的黏附和侵袭试验结果54-55
• 4.9 RAW264.7 细胞吞噬试验结果55-56
• 5 讨论56-59
• 5.1 突变菌株的构建56
• 5.2 RS11565基因的缺失对LM201毒力的影响56-57
• 5.3 RS11570/RS11565双组分系统的后续研究展望57-59
• 6 结论59-60
• 参考文献60-68
• 致谢68

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1 隋建新;林洪;曹立民;王静雪;王光辉;;单增李斯特菌(Listeria monocytogens)鸡卵黄抗体的制备及其抑菌活性研究[J];食品与发酵工业;2009年02期

2 田霞;李远钊;张培正;朱英莲;;即食菜卷和肉汤中单增李斯特菌生长模型及控制研究[J];食品与发酵工业;2005年10期

3 王海艳;刘中学;石新华;赵林立;刘虹;甄宏太;;单增李斯特菌及其表面蛋白的研究进展[J];检验检疫科学;2006年02期

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8 于佳佳;邓兴梅;蒋建军;朱江虹;马勋;;单增李斯特菌新疆临床分离株毒力基因的克隆和序列分析[J];石河子大学学报(自然科学版);2014年02期

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1 龙轶;周小明;邢达;;基于磁珠分离和超分支滚环扩增的单增李斯特菌电化学发光检测[A];第七届全国光生物学学术会议论文摘要集[C];2010年

2 丁建英;韩剑众;;食品中单增李斯特菌的存在现状及检测方法研究进展[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

3 张耀祺;石磊;;分离自生肉的单增李斯特菌的血清型及脉冲场凝胶电泳分型研究[A];“亚运食品安全与广东食品产业创新发展”学术研讨会暨2009年广东省食品学会年会论文集[C];2009年

4 陈慧燕;;单增李斯特菌室间比对活动实验室结果评价[A];2009年卫生检验新技术学术研讨会会刊[C];2009年

5 陈健舜;方维焕;;食品中单增李斯特菌的分子流行病学特征与致病力研究[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（下册）[C];2009年

6 郑华英;江元山;吕均;熊燕;龙一兵;曾莹春;;单增李斯特菌食品分离株多重PCR鉴定分型[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

7 何冬梅;王洪敏;柯昌文;邓小玲;杨杏芬;赖蔚傮;柯碧霞;李柏生;谭海玲;;单增李斯特菌检测基因芯片的研制与评价[A];2011广东省预防医学会学术年会资料汇编[C];2011年

8 斯国静;俞骅;刘涛;胡俊;;单核细胞增生李斯特菌在市售食品中污染现状分析[A];2011年浙江省医学会医学病毒学分会、医学微生物与免疫学分会学术年会论文汇编[C];2011年

9 郭明星;朱堂明;陈晨;赵晖;王振华;陈建军;徐新生;;湖北省水产品中单增李斯特菌基因分型研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

10 程超男;张笑言;彭媛;白家磊;刘原媛;宁保安;高志贤;;基于3-巯基丙酸修饰金电极构建电化学免疫传感器检测牛奶中的单增李斯特菌[A];天津市生物医学工程学会第三十三届学术年会论文集[C];2013年

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1 ;重视单增李斯特菌风险防范[N];中国医药报;2014年

2 张启华邋姜文辉;烟台首次从进口水产品中检出单增李斯特菌[N];中国国门时报;2007年

3 记者　 胡其峰;进口日本食品连续出现质量问题[N];光明日报;2006年

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7 高亚兰;小心：进口日本食品频现质量问题[N];国际商报;2006年

8 记者　黄全权;进口日本食品连续出现问题[N];人民日报;2006年

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1 方春;单核细胞增生李斯特菌谱系Ⅲ强毒株与弱毒菌株比较基因组及致病力差异机制[D];浙江大学;2015年

2 亢春雨;食源性单核增生性李斯特氏菌的分布、遗传多态性及其毒理机制研究[D];河北农业大学;2015年

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5 夏叶;单核细胞增生李斯特菌：应激转录组学与RsbX对SigB表达和细菌存活的调控[D];浙江大学;2015年

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7 王建锋;抗单核细胞增多性李斯特菌溶血素化合物的发现及作用机制研究[D];吉林大学;2015年

8 隋建新;单增李斯特菌鸡卵黄抗体的抑菌性能及其机理研究[D];中国海洋大学;2010年

9 田静;熟肉制品中单增李斯特菌的风险评估及风险管理措施的研究[D];中国疾病预防控制中心;2010年

10 张辉;单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性及胶体金试纸研制[D];吉林大学;2008年

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1 冯晓慧;单增李斯特菌在肉牛屠宰过程中的流行特点及其热失活模型的建立[D];山东农业大学;2011年

2 于旖斯;食品中单增李斯特菌的分离、鉴定及抑制研究[D];大连工业大学;2010年

3 王昊宇;食品中单增李斯特菌的分离鉴定及PCR快速检测方法的研究[D];大连工业大学;2013年

4 周旋;姜黄素抑制单增李斯特菌溶血素活性的分子机制研究[D];吉林大学;2016年

5 张星星;漆黄素对单增李斯特菌感染妊娠小鼠流产的保护作用[D];吉林大学;2016年

6 解新方;单增李斯特菌表面增强拉曼光谱检测技术研究[D];天津科技大学;2015年

7 李云霞;纳米磁珠对单增李斯特菌低场磁共振检测的影响研究[D];上海师范大学;2016年

8 欧娅;单增李斯特菌双组分系统应答调节蛋白基因RS11565的功能研究[D];华中农业大学;2016年

9 王艳;模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立及单增李斯特菌多位点序列分型[D];中国疾病预防控制中心;2009年

10 梁启平;进口水产品中单增李斯特菌的监测与风险分析[D];浙江大学;2009年

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