鼠伤寒沙门氏菌外排泵AcrAB失活对其它外排泵表达的影响

发布时间：2017-08-04 12:17

  本文关键词：鼠伤寒沙门氏菌外排泵AcrAB失活对其它外排泵表达的影响

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【摘要】：沙门氏菌是一类主要食源性病原菌,在沙门氏菌诱发感染病例中,鼠伤寒沙门氏菌占很高的分离率。氟喹诺酮类药作为治疗沙门氏菌病的首选药物被广泛用于临床。在氟喹诺酮类选择压力下,鼠伤寒沙门氏菌很快对其产生耐药,其中最主要的耐药机制是增强的外排作用和拓扑异构酶突变。本实验选取敏感的鼠伤寒沙门氏菌临床株SH10作为亲本菌,建立了pKD46和噬菌体P22介导的基因敲除的方法。为研究AcrAB-TolC及其调控因子对SH10敏感性的作用,我们分别构建了外排泵和调控因子的基因缺失株并采用二倍琼脂稀释法测定了缺失株的MIC。结果显示,与原菌SH10相比,这些缺失株对受试的15种抗生素的MIC值没有发生明显的变化,表明缺失acrAB及其调控因子没有对SH10的药物敏感性产生显著的影响。另外,我们在半固体培养基上测定了这些缺失株的迁移力。数据显示,缺失marA、ramA和sox R后,细菌在培养基上移动的半径由27 mm下降至18.3-21.7 mm(P0.05或P0.01);而缺失marR、ramR和soxS时,细菌的移动半径由27 mm升高至31-33.7 mm(P0.05)。缺失acrA或acrB时,细菌的移动半径也增大,但变化不显著;而缺失tolC时,细菌的移动半径减小。以上结果表明,转录调控因子marA、ramA和soxR对鼠伤寒沙门氏菌SH10的迁移力起着正向调控的作用。为研究鼠伤寒沙门氏菌耐多药外排泵AcrAB-TolC是否存在反馈调节机制,我们检测了SH10在加入外排泵抑制剂PAβN后acrAB-tolC各基因的表达情况,以及缺失acrA或acrB后剩余外排泵基因和调控因子的表达水平。荧光定量数据显示,加入PAβN后,acrA和acrB的表达水平升高到原来的2.32倍和1.57倍,marA和ramA的表达水平分别提高到原来的1.40倍和2.94倍。当缺失acrA时,acrB和tolC的表达水平升高到原来的2.92倍和2.48倍,而marA和ramA则分别升高到原来的2.29倍和2.89倍。当缺失tolC时,acrA和acrB的表达升高了2.48倍和2.45倍,mar A和ramA分别升高了3.03倍和3.07倍。因此,当沙门氏菌外排泵AcrAB-TolC功能失活时,细菌会通过激活转录调控基因ramA和marA反过来促进acrAB-tolC的表达。为研究鼠伤寒沙门氏菌SH10主要外排泵acrAB与其余外排泵间的关系,我们量测定了?acrAB::kan缺失株中另外八种外排泵基因acr F、acrD、mdsB、mdtB、macA、emrA、mdfA和mdtK的表达水平。除mdtK外,其余的外排泵的表达水平均不同程度上调(1.59-2.26倍,P0.05)。同样地,我们还检测了通过P22构建的?acrABmarA::kan、?acrABramA::kan和?acrABsoxS::kan双基因缺失株中另外八种外排泵的表达情况。结果显示,缺失?acrAB::kan中的调控基因marA、ram A和soxS,可使缺失株中其它外排泵的表达水平显著地降低(0.26-0.85倍、0.18-0.88倍和0.27-1.26倍,P0.05)。另外,我们也检测了?acrEF::kan、?acrD::kan、?mdtABC::kan、?mdsABC::kan、?macAB::kan、?emrAB::kan、?mdfA::kan和?mdtK::kan中acrAB-tolC及其调控因子的表达情况。结果显示,在这八株外排泵缺失株中,acrAB-tolC及其转录调控基因marA和ramA的表达水平都显著的增加(P0.05),而且其迁移力也有所增强。以上结果表明,沙门氏菌SH10可以通过marA和ramA来实现acrAB与其它外排泵间的相互调节。在环丙沙星的选择压力下,我们在体外筛选出鼠伤寒沙门氏菌临床株SH10和标准株SL1344的不同耐药水平的诱导菌。其中SH-1和SL-1为敏感性降低株(MICcip为0.125μg/mL和0.25μg/mL),SH-2和SL-2为低水平耐药株(MICcip均为2μg/mL),SH-3和SL-3为高水平耐药菌(MICcip为8μg/mL)。QRDR突变检测结果显示,这些不同耐药水平的诱导菌中,只在GyrA的83位检测到突变S83F。于是,我们又检测了诱导菌中主要耐多药泵acrAB-tolC及其主要的转录激活因子ramA、marA和soxS的表达情况。结果显示,随着耐药水平的升高,外排泵的表达水平也不断随之升高(P0.05),并且是由ramA介导的。MIC结果显示,高水平耐压株SH-3和SL-3表现为多重耐药。另外我们也检测了这些诱导菌的适应性,结果显示随着细菌耐药性的增加,细菌的生长能力、细菌毒力和迁移力都呈现不断下降的趋势。结论:当鼠伤寒沙门氏菌SH10耐多药泵acrAB功能失活时,细菌一方面可以通过全局性的转录调控因子marA和ramA反馈性促进acrAB的表达;另一方面,细菌可以通过激活marA和ramA的表达来促进其它的外排泵的表达尤其是RND家族的外排泵,以补偿细菌丧失的外排功能。另外,当其它外排泵缺失时,也会通过转录因子反过来影响acrAB的表达。体外诱导实验表明,AcrABTolC在SH10和SL1344获得高水平耐药的过程中发挥着最主要的作用。
【关键词】：鼠伤寒沙门氏菌 多重耐药泵 基因敲除 调控机制
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 1 前言9-16
• 2 材料与方法16-32
• 2.1 材料16-19
• 2.1.1 实验菌株和参考菌株的来源16
• 2.1.2 常用的培养基和试剂16-17
• 2.1.3 Real-Time PCR用试剂17
• 2.1.4 常用的试剂盒17
• 2.1.5 常用试剂的配制17-18
• 2.1.6 主要仪器设备18-19
• 2.2 方法19-32
• 2.2.1 沙门氏菌敲除株的构建19-23
• 2.2.2 噬菌体P22介导的沙门氏菌基因敲除23-24
• 2.2.3 鼠伤寒沙门氏菌外排泵基因表达水平的检测24-28
• 2.2.4 沙门氏菌基因缺失株迁移力检测28
• 2.2.5 沙门氏菌的体外诱导28-29
• 2.2.6 QRDR（s）与ramR-ramA基因突变的检测29-31
• 2.2.7 诱导菌生长曲线的测定31
• 2.2.8 细胞侵袭实验31-32
• 2.2.9 二倍琼脂稀释法测定最小抑菌浓度（MICs）32
• 3 结果与分析32-49
• 3.1 基因敲除株的构建32-37
• 3.1.1 pKD46介导的基因敲除32-34
• 3.1.2 噬菌体P22介导的基因敲除34-35
• 3.1.3 acrAB-tolC及其调控因子缺失株耐药性和迁移力的测定35-37
• 3.2 沙门氏菌中RND外排泵AcrAB-TolC对自身的反馈调节37-39
• 3.3 外排泵系统间的相互调节机制39-44
• 3.4 环丙沙星选择压力下沙门氏菌耐药机制的研究44-47
• 3.5 环丙沙星选择压力下沙门氏菌适应性的研究47-49
• 4.讨论49-54
• 全文总结54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 曾晓芳;畜产品中沙门氏菌污染的检测与控制[J];四川畜牧兽医;2003年04期

2 张燕,朱超;我国沙门氏菌病和菌型分布概况[J];现代预防医学;2002年03期

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本文编号：619526