猪肺炎支原体烯醇化酶的原核表达与部分生物学功能分析

发布时间：2017-08-05 09:37

  本文关键词：猪肺炎支原体烯醇化酶的原核表达与部分生物学功能分析

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【摘要】：猪肺炎支原体(Mhp)可导致猪的慢性呼吸道疾病,对养猪业危害严重。病原毒力因子研究将为该病防控提供基础。本试验对Mhp烯醇化酶进行了原核表达及功能分析。通过GenBank查得Mhp烯醇化酶的基因序列,利用引物设计软件Primer5.0设计并合成引物,通过PCR技术来扩增目的基因,通过测序时发现序列中730bp处含有1个稀有密码子,随后我们利用SOE-PCR方法分别对前段773bp和后段516bp序列进行基因扩增并连接,将扩增到的片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出重组质粒pGEX-4T-1/Eno。将重组质粒pGEX-4T-1/Eno导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,试验发现经1mM IPTG诱导表达24h时目的蛋白的表达量最高,并用GST Fusion Protein Purification Kit进行蛋白纯化,得到较纯的目的蛋白。Western-blot证实MhprEno重组蛋白的反应原性良好。本试验用纯化后的MhprEno重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法检测,并以纯化的MhprEno蛋白作为包被抗原来检测MhprEno蛋白免疫小鼠后的血清中抗体水平。结果表明,MhprEno蛋白能诱导小鼠使之体内产生较高水平的抗体,结果提示MhprEno蛋白免疫原性比较好。同时,通过Western-blot和ELISA方法检测MhprEno小鼠抗体与不同Mhp菌株的反应性。结果显示,小鼠抗体与不同菌株均具有良好的反应性。用纯化好的Eno蛋白进行细胞损伤及黏附试验。结果显示,MhprEno蛋白作用16小时后对STEC细胞有剂量依赖性的损伤,且能抑制Mhp粘附STEC细胞。综合以上,本试验构建了MhpEno重组表达菌,并成功获得了MhprEno蛋白,初步证实了该蛋白具有抗原反应性以及损伤STEC细胞和抗Mhp黏附细胞的功能,从而为进一步更深入研究探讨Mhp的致病机理及防控方法等提供了必要的理论和试验基础。
【关键词】：猪肺炎支原体 烯醇化酶 免疫原性
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.62
【目录】：

• 摘要8-9
• 第一章 文献综述9-17
• 1 猪肺炎支原体概述9
• 2 猪肺炎支原体致病机理及相关免疫原蛋白的研究9-13
• 2.1 猪肺炎支原体致病机理概述9
• 2.2 Mhp致病机理研究进展9-11
• 2.2.1 Mhp入侵机制研究进展9-10
• 2.2.2 Mhp损伤及凋亡机制研究进展10-11
• 2.3 猪肺炎支原体毒力相关因子的研究进展11-12
• 2.4 病原与宿主互作研究12-13
• 3 烯醇化酶生物功能研究进展13
• 4 烯醇化酶在病原菌方面的研究进展13-15
• 5 烯醇化酶在支原体方面研究进展15-17
• 第二章 猪肺炎支原体烯醇化酶基因的原核克隆表达及鉴定17-32
• 1 试验材料17-18
• 1.1 质粒和菌株17
• 1.2 主要材料与试剂17
• 1.3 试验仪器17-18
• 2 试验方法18-25
• 2.1 引物的设计与合成18
• 2.2 Mhp168菌液DNA的提取18
• 2.3 Mhp/Eno基因的PCR扩增18-19
• 2.4 目的基因的回收及纯化19
• 2.5 Mhp Eno基因与pMD18-T载体的连接19-20
• 2.6 连接产物转化20
• 2.7 重组质粒DNA的提取、鉴定及测序20-21
• 2.7.1 重组质粒的提取20
• 2.7.2 重组质粒的PCR鉴定20
• 2.7.3 重组质粒的酶切鉴定20-21
• 2.7.4 重组质粒的测序鉴定21
• 2.8 载体pGEX-4T-1的获取21
• 2.9 构建pGEX-4T-1/Mhp Eno表达载体21-22
• 2.10 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定22
• 2.10.1 连接产物的转化22
• 2.10.2 重组质粒DNA的提取22
• 2.10.3 重组质粒的PCR鉴定22
• 2.10.4 重组质粒的酶切鉴定22
• 2.10.5 重组质粒的测序鉴定22
• 2.11 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE检测22-23
• 2.11.1 重组质粒的诱导表达22
• 2.11.2 表达产物的SDS-PAGE检测22-23
• 2.11.3 最佳诱导条件的确定23
• 2.11.4 表达产物的存在状态分析23
• 2.12 蛋白的纯化23-24
• 2.13 表达产物的Western-blot检测24-25
• 3 结果与分析25-30
• 3.1 基因的获取25
• 3.2 猪肺炎支原体Eno基因的扩增结果25-26
• 3.3 pMD18-T/Eno的双酶切鉴定结果26
• 3.4 pMD18-T/Eno的PCR鉴定结果26-27
• 3.5 pGEX-4T-1/Eno的双酶切鉴定结果27
• 3.6 pGEX-4T-1/Eno的PCR鉴定结果27-28
• 3.7 诱导蛋白的SDS-PAGE结果28
• 3.8 筛选诱导表达条件的结果28-29
• 3.9 纯化蛋白的结果29-30
• 3.10 表达产物的Western-blot的鉴定30
• 4 小结30-32
• 第三章 猪肺炎支原体烯醇化酶的部分生物学功能分析32-42
• 试验一 Mhp rEno蛋白免疫原性分析32-36
• 1 材料32
• 1.1 仪器32
• 1.2 试验材料及耗材32
• 2 方法32-34
• 2.1 测定蛋白质浓度32
• 2.2 BALB/c小鼠的免疫32-33
• 2.3 间接ELISA方法33
• 2.4 检测Mhp rEno蛋白免疫小鼠抗体水平33
• 2.5 鼠抗Mhp rEno血清与不同Mhp菌株反应试验33-34
• 2.5.1 制备全菌蛋白33
• 2.5.2 鼠抗Mhp rEno血清与不同菌株蛋白反应33-34
• 3 结果34-36
• 3.1 Mhp rEno蛋白免疫小鼠抗体水平34
• 3.2 不同菌株蛋白反应试验34-36
• 试验二 猪肺炎支原体烯醇化酶蛋白对STEC细胞的黏附及黏附抑制作用分析36-40
• 1 试验材料36
• 2 试验方法36-38
• 2.1 STEC细胞膜蛋白的制备36
• 2.2 微孔板检测36-37
• 2.3 间接免疫荧光检测Mhp rEno蛋白抗Mhp黏附STEC细胞37
• 2.4 间接免疫荧光检测Mhp rEno抗体抗Mhp黏附STEC细胞37-38
• 3 试验结果38-40
• 3.1 微孔板黏附试验定量检测蛋白黏附能力结果38
• 3.2 间接免疫荧光检测Mhp rEno蛋白抗Mhp黏附STEC细胞结果38-39
• 3.3 间接免疫荧光检测Mhp rEno抗体抗Mhp黏附STEC细胞结果39-40
• 试验三 猪肺炎支原体烯醇化酶蛋白对STEC细胞的损伤分析40-42
• 1 试验材料40
• 1.1 细胞40
• 1.2 主要试剂40
• 1.3 主要仪器40
• 2 试验方法40-41
• 2.1 Mhp rEno蛋白对STEC细胞活力的影响40-41
• 2.1.1 STEC细胞培养40
• 2.1.2 Mhp制备40
• 2.1.3 CCK-8细胞活力试剂盒测定不同浓度Mhp rEno对STEC细胞的损伤40-41
• 2.1.4 DAPI染色观察细胞损伤的形态变化41
• 3 试验结果41-42
• 3.1 CCK-8细胞活力检测试剂盒检测Mhp rEno蛋白的存在对STEC细胞的影响结果41-42
• 3.2 Mhp rEno蛋白的存在对STEC细胞损伤后DAPI染色结果42
• 总结42-44
• 讨论44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-52
• Abstract52-54
• 附录54-56
• 致谢56

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本文编号：624249