鸭PPAR基因家族功能分歧分析及启动子克

发布时间：2017-08-07 19:05

  本文关键词：鸭PPAR基因家族功能分歧分析及启动子克隆、活性调控元件筛选

  更多相关文章： 鸭 PPAR 基因家族 启动子

【摘要】：PPAR基因家族(PPARs)是调控脂肪酸及其衍生物等相关基因表达的一组受体,包括α、β(或δ)和γ三种亚型。在家禽上,PPARs被发现与皮下脂肪、肥肝和免疫抗逆等重要经济性状有关,但PPARs在同一生物过程中的调控却表现出功能上的差异。这些差异可能与PPARs的进化分歧和表达调控差异有关。本文拟对PPAR基因家族进化分歧进行分析,明确成员间的进化关系,了解家族成员功能产生分歧的可能原因,再通过分析鸭PPAR基因家族启动子区的结构差异,筛选出与鸭PPARs差异调控相关的活性元件,并验证部分活性元件与基因表达调控的关系。通过这些研究,为鸭PPARs基因表达调控,以及为PPARs调控禽类重要经济性状形成的机制研究奠定基础。研究结果表明：PPAR家族在鱼类中先出现分歧,然后是两栖类,接着是鸟类和哺乳类。进化树显示a、β、γ三种基因亚型出现明显的分歧,其中γ与其它两种亚型分歧较早。绝大部分物种PPARs氨基酸序列上都存在ZnF_C4和HOLI结构域。HOLI和ZnF_C4结构域的Ka/Ks值,以及启动子调控元件数量,都支持a和β在进化上关系更近,γ更原始。克隆获得的鸭PPARα、PPARβ和PPARγ启动子片段长度分别为2526bp、1631bp和2942bp,与原鸡同源性分别为70%、71%和75%。鸭PPARs启动子区域内存在典型的CAAT-box、TATA-box位点,无CpG岛。构建了鸭PPARs各成员荧光素酶报告基因载体,其中α和β各7个,γ6个,细胞水平实验筛选到鸭PPARa基因启动子上游片段-150bp～-66bp和片段-1059bp～-876bp,以及β上游片段675bp～-540bp和｜上游片段-580bp～-360bp具有正向调控区域,在β上游片段-1267bp～-1036bp内含有抑制转录活性的调节区域。启动子活性区域分析,筛选出PPARs各成员共有3个转录因子,包括NF-1、Sp1和C/EBPa。NF-1、Spl、C/EBPα和PPARs在鸭胚胎期骨骼肌发育过程中的表达模式表明,3个转录因子在鸭胚胎骨骼肌发育中都有表达。双向聚类分析发现,Sp1与鸭PPARβ和PPARγ存在较高的同源性,NF-1与PPARa有较高同源性。NF-1可能是PPARα与其它2个家族成员功能分歧的原因之一,Sp1则可能导致PPARβ和PPARγ功能出现分歧。综上所述,PPARγ可能是PPAR基因家族的原始祖先基因,PPARγ基因在进化过程中受到正选择的程度是PPAR基因家族中最高的。克隆获得的鸭PPARα、PPARβ和PPARγ启动子片段长度分别为2526bp、1631bp和2942bp。筛选到鸭PPARα基因启动子上游片段-150bp～-66bp和片段-1059bp～-876bp,以及β上游片段675bp～-540bp和γ上游片段-580bp～-360bp具有正向调控区域,在β上游片段-1267bp--1036bp内含有抑制转录活性的调节区域。PARs各成员共有3个转录因子,包括NF-1、sp1和C/EBPa。Sp1与鸭PPARβ和PPARγ存在较高的同源性,NF-1与PPARa有较高同源性。NF-1是PPARα与其它2个家族成员功能分歧的原因之一,Sp1则导致PARβ和PPAR γ功能出现分歧。
【关键词】：鸭 PPAR 基因家族 启动子
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S834
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 主要符号说明9-14
• 前言14
• 1 文献综述14-25
• 1.1 PPAR基因家族的结构与功能14-17
• 1.1.1 PPAR基因家族组成及结构14-16
• 1.1.2 PPARs主要功能16-17
• 1.1.2.1 PPARs与糖脂代谢16
• 1.1.2.2 PPARs与脂肪细胞16-17
• 1.1.2.3 PPARs与成肌细胞17
• 1.1.2.4 PPARs与免疫17
• 1.2 PPAR基因家族成员间功能分歧及研究17-20
• 1.2.1 PPARs基因在脂肪细胞分化及脂质代谢中的差异17-18
• 1.2.2 PPARs基因在胚胎发育过程中的差异18-19
• 1.2.3 PPAR基因家族分子进化19-20
• 1.3 PPARs与家禽重要经济性状形成20-22
• 1.3.1 PPARs与禽类体脂沉积20-21
• 1.3.2 PPARs与禽类肉质21
• 1.3.3 PPARs与肥肝21-22
• 1.4 PPARs的转录调控研究进展22-24
• 1.4.1 启动子及活性调控区域22
• 1.4.2 PPARs的转录调控研究22-24
• 1.5 研究目的及意义24-25
• 2 材料与方法25-39
• 2.1 试验材料25-27
• 2.1.1 样品来源25
• 2.1.2 主要试剂盒及耗材25
• 2.1.3 试剂配制25-26
• 2.1.4 仪器设备26
• 2.1.5 相关分析软件26-27
• 2.2 方法27-39
• 2.2.1 PPAR基因家族分子进化分析27-28
• 2.2.1.1 蛋白质结构域27
• 2.2.1.2 进化树构建27
• 2.2.1.3 氨基酸选择压力27
• 2.2.1.4 转录因子27-28
• 2.2.2 鸭基因组DNA的提取和检测28
• 2.2.2.1 鸭肌肉组织中的DNA提取28
• 2.2.2.2 检测所提取的DNA质量28
• 2.2.3 鸭PPARs基因启动子区扩增28-30
• 2.2.3.1 设计所要扩增的鸭PPARs基因启动子引物28-29
• 2.2.3.2 PCR扩增目的片段29
• 2.2.3.3 回收凝胶并纯化PCR产物29
• 2.2.3.4 回收纯化的目的片段与T载体连接29-30
• 2.2.3.5 重组质粒转化30
• 2.2.3.6 阳性克隆及测序鉴定30
• 2.2.4 鸭PPARs基因启动子的生物信息学分析30-31
• 2.2.5 含有鸭PPARs基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建31-33
• 2.2.5.1 启动子5’递减片段的荧光素酶报告基因载体构建引物计31
• 2.2.5.2 递减片段的PCR扩增31-32
• 2.2.5.3 PCR产物的纯化和回收及克隆和测序32
• 2.2.5.4 重组质粒DNA的提取32
• 2.2.5.5 重组质粒双酶切和产物纯化回收32-33
• 2.2.5.6 pGL3-basic与PPARs重组载体构建33
• 2.2.5.7 重组pGL3-basic-PPARs载体克隆及测序33
• 2.2.6 鸭PPARs基因启动子核心区域的鉴定33-35
• 2.2.6.1 无内毒素质粒pGL3-basic-PPARs的提取33-34
• 2.2.6.2 HEK293细胞培养34
• 2.2.6.3 重组质粒瞬时转染34
• 2.2.6.4 荧光素酶报告基因活性检测34-35
• 2.2.6.5 数据统计分析35
• 2.2.7 鸭PPARs基因启动子活性调控元件筛选35-39
• 2.2.7.1 RNA提取及检测35
• 2.2.7.2 cDNA合成35-37
• 2.2.7.3 定量引物设计37
• 2.2.7.4 qRT-PCR检测37-39
• 3 结果与分析39-59
• 3.1 PPAR基因家族分子进化分析39-47
• 3.1.1 蛋白质结构域关系39-41
• 3.1.2 PPAR基因家族的蛋白质进化树41-42
• 3.1.3 氨基酸位点选择压力分析42-46
• 3.1.4 5’端启动子区域对应转录因子结合位点46-47
• 3.2 鸭PPARs基因启动子区扩增47-52
• 3.2.1 鸭PPARs启动子克隆及同源性比对47-48
• 3.2.2 鸭PPARs启动子序列特点48-52
• 3.3 鸭PGL3-BASIc-PPARs重组载体的构建52-53
• 3.4 鸭PPARs启动子活性调控区域鉴定53-56
• 3.4.1 荧光素酶相对活性检测53-54
• 3.4.2 鸭PPARs基因启动子活性区域比较54-56
• 3.5 鸭PPARs基因启动子活性调控元件验证56-59
• 4 讨论59-64
• 4.1 PPAR基因家族分子进化与调控59-61
• 4.2 鸭PPARs基因启动子序列特点61-62
• 4.3 鸭PPARs的活性调控元件异同62-64
• 5 结论64-66
• 参考文献66-75
• 致谢75-76
• 附件76-82
• 研究生期间发表的文章82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 王丽;那威;王宇祥;王彦博;王宁;王启贵;李玉茂;李辉;;鸡PPARγ基因的表达特性及其对脂肪细胞增殖分化的影响[J];遗传;2012年04期

2 田亚东;亢娟娟;孙桂荣;韩瑞丽;康相涛;;PPARα基因对安卡×固始鸡资源群胴体品质的遗传效应分析[J];华北农学报;2010年06期

3 苏胜彦;李齐发;刘振山;王艳平;吴松青;谢庄;;朗德鹅填饲后不同组织PPARγ基因mRNA表达量差异的初步研究[J];畜牧兽医学报;2008年07期

4 张立凡,连林生,鲁绍雄;生物信息学在动物遗传育种中的应用[J];畜牧与兽医;2004年07期

5 王颖,麦维军,梁承邺,张明永;高等植物启动子的研究进展[J];西北植物学报;2003年11期

6 亓立峰,许梓荣;过氧化物酶体增殖剂受体与脂质代谢调控[J];中国兽药杂志;2003年07期

7 孟和,王桂华,王启贵,赵建国,顾志良,王宇祥,李辉;鸡PPAR基因单核苷酸多态与脂肪性状相关的研究[J];遗传学报;2002年02期

，

本文编号：636206