鸡TAP1基因多态性及其在先天免疫中mRNA表达规律研究

发布时间：2017-08-08 13:39

  本文关键词：鸡TAP1基因多态性及其在先天免疫中mRNA表达规律研究

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【摘要】：我国是养禽大国且产业发展迅速,而疾病是限制养殖业发展的一个重要因素。长期以来,疾病的控制主要依赖疫苗,由于病原微生物的变异及毒力的不断增强等原因,使得疫苗使用效果不断下降。因此,研究者开始转向抗病育种研究,期望能从遗传上提高家禽的抗病能力。研究表明,在家禽中MHC(major histocompatibility complex,主要组织相容性复合体)基因与多种疾病的抗性存在高度相关性,是家禽抗病育种研究中的优选标记基因。在鸡上,位于MHC基因核心位置的TAP1基因(Transporter associated antigen processing,抗原处理相关转运体),是编码一类在内源性抗原的呈递过程中起着重要作用的转运蛋白的基因,与抗病性、先天免疫应答及经济性状间具有相关性。本研究以29个中国地方鸡种和国外鸡种为研究对象,研究不同鸡种TAP1基因多态性,对这些鸡种进行单倍型判定;并对广西黄鸡感染肠炎沙门氏菌后的TAP1表达量变化及不同单倍型个体TAP1表达规律进行研究,主要结果如下：1.为了研究TAP1基因的多态性,本研究选取国内外29个鸡种,每个鸡种以10个个体的DNA混池对TAP1基因进行目标捕获测序,测序结果与NCBI中参考序列(登录号：427727)比较后发现：在TAP1基因外显子上,青脚麻鸡是存在SNP最多的品种,文昌鸡只存在1个SNP,而如皋黄鸡,雪山鸡和太湖鸡不存在SNP。同时,研究发现国外鸡种,如罗斯鸡,隐性白羽鸡,安卡鸡和AA鸡的TAP1基因SNP突变数量较地方鸡种少；国外品种的INDEL突变也相对较少。在TAP1基因内含子上,乌骨鸡、SPF鸡、雪山鸡、藏鸡和杂交鸡所含SNP数量较多,广西黄鸡和绿壳蛋鸡所含INDEL数量较多；国内外品种比较发现,国外鸡种所含突变数量亦较国内地方品种少。在TAP1基因启动子上,在斗鸡、固始鸡、萧山鸡、鹿苑鸡和斗鸡杂交品种在67309位置存在10 bp的缺失,而绿壳蛋鸡在此出现了20 bp缺失,出现缺失突变的均为国内地方品种。以上结果表明我国地方鸡种TAP1基因在外显子和启动子区具有丰富的遗传多样性,TAP1基因可作为先天免疫研究的候选基因。2.根据TAP1基因启动子多态性重点对广西黄鸡进行不同单倍型筛选,结果发现TAP1基因启动子同样存在1个10 bp的缺失,广西黄鸡中存在AA、AB和BB 3种基因型；野生等位基因(与参考序列中红色原鸡一致)与突变等位基因频率分别为0.847、0.153,PIC为0.239,平均杂合度为0.278,经卡方适合性检验,广西黄鸡群体中TAP1基因处于Hardy-Weinberg平衡状态。经JASPAR数据库预测,TAP1基因启动子lObp缺失区域可能存在3个转录因子结合位点。3.1日龄广西黄鸡感染肠炎沙门氏菌后0-21 dpi(day-post-infection)盲肠载菌量结果表明,攻毒组沙门氏菌载菌量5 d最高,2 h到5 d载菌量逐渐升高,5 d到21 d逐渐降低。血浆中细胞因子水平变化结果表明,对照组与攻毒组细胞因子浓度峰值出现时间点不同。IL-1α、IFN-γ浓度在对照组都是在24 h达到最大值,而攻毒组则是4 h时最大值。ⅠgY浓度在对照组24 h达到第一个峰值,在攻毒组则持续缓慢上升。ⅠgM浓度在对照组变化不明显,在攻毒组,细胞因子ⅠgM浓度在2 h快速升高到最大值,2 h到4 h浓度又快速下降,4 h之后浓度缓慢下降；表明广西黄鸡早期免疫反应迅速,2 h-4 h属于急性反应期,5 d后属于免疫相对稳定期。4.通过QRT-PCR方法检测1日龄广西黄鸡感染肠炎沙门氏菌后0-21 dpi TAP1基因mRNA表达水平变化,结果表明,TAP1在心脏、肝脏、胸腺、法氏囊四个不同组织中广泛表达,但胸腺和法氏囊中整体表达量显著高于其他组织(P0.05)。感染组和对照组TAP1基因表达量,感染组基因显著表达高于对照组(P0.05)。对照组TAP1基因表达量随日龄增加而增加,在3 dpi的表达量显著升高,表明3 d是免疫状态切换的关键时期。对于不同感染时间TAP1表达水平比较,不同组织在3 dpi表达量均最高,在1 dpi的表达量显著升高,3 dpi之后表达量下降,进一步说明沙门氏菌感染后能引起鸡只迅速产生免疫反应,且TAP1基因确实参与广西黄鸡的各种免疫反应。5.采用QRT-PCR方法检测广西黄鸡中突变型和野生型个体的TAP1 mRNA表达水平变化,在对照组中同一组织中,突变型与野生型个体在不同时间点的TAP1表达量差异不显著(P0.05)。在攻毒组中,突变型与对照组野生型个体TAP1表达量也存在同样趋势,表明TAP1启动子区在67309位置10 bp的缺失突变对TAP1的mRNA表达并无显著影响(P0.05),不同单倍型个体间先天免疫性能无显著差异(P0.05)。
【关键词】：鸡 TAP1 多态性 沙门氏菌 先天免疫
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 文献综述10-18
• 1 主要组织相容性复合体(MHC)的研究进展10-13
• 1.1 MHC的研究背景10-11
• 1.2 鸡的MHC结构、功能和研究现状11-13
• 2 TAP基因概述及其研究进展13-14
• 3 目标区域捕获测序14-15
• 4 实时荧光定量PCR15-16
• 4.1 SYBR Green染料法15
• 4.2 以参照基因作为标准进行相对定量15-16
• 4.3 实验数据分析方法16
• 5 本研究的目的和意义16-18
• 第二章 不同品种鸡TAP1基因多态性分析18-36
• 1 实验材料18
• 1.1 实验动物18
• 1.2 主要仪器18
• 1.3 主要试剂18
• 2 实验方法18-20
• 2.1 样品采集与处理18-19
• 2.2 目标区域捕获测序19
• 2.3 测序数据的整理及分析19
• 2.4 测序结果PCR验证19-20
• 3 结果与分析20-34
• 3.1 TAP1基因外显子多态性分析20-26
• 3.2 TAP1基因启动子及内含子区多态性分析26-32
• 3.3 不同鸡品种的SNP比例分析32-33
• 3.4 对目标捕获测序结果进行PCR验证33-34
• 4 讨论34-36
• 第三章 广西黄鸡TAP1基因启动子多态性分析36-43
• 1 实验材料36
• 1.1 试验动物36
• 1.2 实验仪器36
• 1.3 实验试剂36
• 2 实验方法36-39
• 2.1 DNA提取36-37
• 2.2 引物的设计与合成37
• 2.3 PCR反应体系与反应程序37-38
• 2.4 群体遗传多样性分析38-39
• 3 结果与分析39-41
• 3.1 引物扩增效果及测序结果39-40
• 3.2 TAP1基因启动子区遗传分析40-41
• 3.3 TAP1基因启动子突变区转录因子分析41
• 4 讨论41-43
• 第四章 广西黄鸡TAP1基因mRNA表达规律分析43-60
• 1 实验材料43
• 1.1 实验菌株43
• 1.2 实验动物43
• 1.3 实验仪器43
• 1.4 实验试剂43
• 2 实验方法43-48
• 2.1 攻毒前菌株的准备和污染检测43-44
• 2.2 攻毒和样品采集44
• 2.3 盲肠内载菌量检测44
• 2.4 血浆IL-1α,IFNγ,IgY和IgM浓度检测44-45
• 2.5 Trizol法提取总RNA及RNA检测45-46
• 2.6 RNA样品的反转录46
• 2.7 引物的设计与合成46-47
• 2.8 荧光定量PCR反应体系及反应程序47-48
• 2.9 数据处理及统计分析48
• 3 结果与分析48-58
• 3.1 沙门氏菌感染后盲肠载菌量变化48-49
• 3.2 沙门氏菌感染后细胞因子水平变化49-51
• 3.3 总RNA的纯度与完整性51-52
• 3.4 TAP1基因在对照组不同日龄雏鸡中表达规律52-53
• 3.5 TAP1基因不同攻毒时间不同组织中表达规律53-54
• 3.6 TAP1基因在攻毒前后表达水平的表达水平差54-57
• 3.7 TAP1基因在野生型和突变型个体的表达差异57-58
• 4 讨论58-60
• 全文结论60-61
• 参考文献61-66
• 致谢66-67
• 攻读学位期间发表的学术论文目录67-68

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本文编号：640293