3型鸭甲肝病毒在SPF鸡胚上的传代及VP1基因变异规律的研究

发布时间：2017-08-09 01:09

  本文关键词：3型鸭甲肝病毒在SPF鸡胚上的传代及VP1基因变异规律的研究

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【摘要】：鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是3周龄内雏鸭的一种急性、高度接触性和致死性的传染病。患病雏鸭的主要症状是肝炎,其病原是鸭肝炎病毒。该病以病程短、死亡率高、传播速度快为特点,通常发病日龄越小,病死率越高。成年鸭一般可以感染但是不发病,所以又称为小鸭肝炎。鸭病毒性肝炎可由小RNA病毒科禽肝病毒属鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)和星状病毒科禽星状病毒属的鸭星状病毒(duck astrovirus,DAst V)引起。DHAV分为1型、2型和3型3个血清型。当前在我国流行的鸭肝炎病毒主要是DHAV-1,2002年以来DHAV-3在我国被发现并在我国部分地处流行,近年来DHAV-1和DHAV-3在鸭群中混合感染的现象比较普遍。而在我国,疫苗接种是预防鸭肝炎最基本最有效的措施,但生产中使用传统的疫苗往往不能达到令人满意的效果。DHAV-3给养鸭业造成的危害越来越广泛,鸭肝炎的防控情形不容乐观。因此,加快鸭肝炎多价疫苗的深入研究显得尤为重要。DHAV-3基因组中的VP1蛋白作为主要的衣壳蛋白,能够编码病毒主要的保护性抗原位点,并能识别相应的受体,并且在不同毒株中的变异较大,具有最大遗传多样性,其变异的生物学意义值得深入研究。为了驯化DHAV-3野毒株获得弱毒疫苗株,本研究选择五株病毒在SPF鸡胚上进行传代试验,通过对VP1基因的克隆测序以及序列的比对分析,为DHAV-3的遗传变异提供相关的理论依据。本研究主要分为两个部分:第一部分:5株DHAV-3病毒在SPF鸡胚上的传代致弱取5株DHAV-3强毒(1C、2C、3C、4C 4株野毒和分子克隆化病毒5C)经过处理后作为初代毒,经尿囊腔接种9-12日龄SPF鸡胚,接种量为0.2 mL/胚。留存24小时后的死亡鸡胚,在4℃冰箱冷却4-12 h后,无菌收取鸡胚尿囊液并观察胚胎病变,将所收尿囊液对应接入下一批鸡胚,连续传代80代。结果表明:5株DHAV-3病毒鸡胚传代5代之前,24-96h之间鸡胚并无死亡现象,胚体也无明显病变;连续传到第6代时,鸡胚开始出现死亡,传到第19代时,5株病毒接种鸡胚出现全部死亡,但死亡时间不规律;传到第36代后鸡胚死亡时间基本在120h内;传到第55代时鸡胚死亡时间大多集中在48h~72h之间;在73代以后接种的鸡胚的死亡时间基本稳定在36h~48h之间,直到传到80代时胚体的病变明显、死亡时间趋于恒定,稳定在48h。除此之外,在传代的过程中,通过对各毒株各代次死亡的鸡胚进行观察发现,尿囊液呈半透明状,随着传代次数的增加鸡胚的死亡时间缩短,胚体的病理变化越来越明显,胚体发育渐渐变缓慢,胚体严重充血,胚体头部和身体表面及四肢出现大量点状出血,肝脏呈黄绿色或土黄色,有点状或者斑点状出血,胚体的大小比正常鸡胚要小。取4C和5C两株病毒传代后的第2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80代病毒的尿囊液肌肉接种雏鸭进行动物回归试验。试验结果显示4C和5C毒株的前10代病毒可引起雏鸭的发病和死亡,并且器官组织有明显的病理变化。第15代到第80代的鸡胚传代毒都不引起雏鸭发病和死亡,但第15代到第20代病毒可导致雏鸭肝脏出现轻微病变,从第30代开始雏鸭的肝脏不再发生组织性病变,表明经过SPF鸡胚传代后,DHAV-3病毒的毒力逐渐致弱,并且30代以后不再对雏鸭致病,一直到第80代病毒毒力稳定。第二部分:DHAV-3各毒株各代次鸡胚传代毒VP1基因的测序及序列分析将各个毒株传代得到的病毒每隔5-10代进行VP1基因的克隆测序,将得到的基因序列和氨基酸序列分别进行横向和纵向的比较。比对后发现:5株DHAV-3分离株在SPF鸡胚上的变异规律并不相同。在SPF鸡胚上传代的过程中,5株DHAV-3病毒毒力减弱。不同毒株不同代次的VP1蛋白的氨基酸变异位点都发生了反复变异和同步变异的现象,不同毒株的VP1蛋白有不同数目的氨基酸位于高变区,但并不能总结出相同的规律,说明DHAV-3的毒力变化与VP1蛋白的突变没有直接的关系。
【关键词】：DHAV-3 SPF鸡胚 传代 致弱 VP1 变异
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 符号说明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 引言13-32
• 1.1 病毒的病原学14-16
• 1.1.1 DHAV病原学分类14
• 1.1.2 DHAV的形态学14
• 1.1.3 DHAV病毒的抵抗力14-15
• 1.1.4 DHAV的生物学特性15
• 1.1.5 病毒的致病力和致病机理15-16
• 1.2 鸭肝炎病毒的流行病学16-17
• 1.2.1 病毒的宿主17
• 1.2.2 病毒的传播途径17
• 1.3 鸭肝炎病毒的临床症状和病理变化17-18
• 1.4 DHAV的分子生物学研究18-20
• 1.4.1 病毒基因组结构特点18-19
• 1.4.2 DHAV的变异性19-20
• 1.5 VP1蛋白20-21
• 1.6 鸭甲肝病毒的增殖培养和纯化21-23
• 1.6.1 胚胎培养21
• 1.6.2 细胞增殖培养21-23
• 1.6.3 DHAV的纯化23
• 1.7 鸭甲肝病毒的诊断方法23-29
• 1.7.1 病毒的分离23-24
• 1.7.2 病毒的鉴定24
• 1.7.3 临床诊断24-25
• 1.7.4 分子生物学诊断25
• 1.7.5 血清学检测手段25-29
• 1.7.5.1 血清中和试验（Virus-neutralization test, VN）25-26
• 1.7.5.2 琼脂免疫扩散试验26
• 1.7.5.3 间接血凝试验26-27
• 1.7.5.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）27-28
• 1.7.5.5 免疫组化技术28-29
• 1.7.5.5 其他血清学诊断方法29
• 1.8 DHAV的预防和治疗29-30
• 1.9 本研究的目的和意义30-32
• 2 材料与方法32-41
• 2.1 材料32-34
• 2.1.1 病料和菌株32
• 2.1.2 实验动物32
• 2.1.3 主要仪器32
• 2.1.4 主要试剂32
• 2.1.5 实验所用溶液配制32-33
• 2.1.6 引物设计和合成33-34
• 2.2 方法34-41
• 2.2.1 DHAV-35 株毒在SPF鸡胚上的传代试验34
• 2.2.2 各毒株各代次鸡胚传代毒VP1基因的测序34-41
• 2.2.2.1 病毒RNA的提取34-35
• 2.2.2.2 病毒的RT-PCR鉴定35
• 2.2.2.3 PCR扩增35-36
• 2.2.2.4 PCR产物的回收36-37
• 2.2.2.5 连接37
• 2.2.2.6 DH5a大肠杆菌感受态细胞的制备37-38
• 2.2.2.7 转化38
• 2.2.2.8 质粒DNA的提取38-39
• 2.2.2.9 重组质粒的双酶切鉴定39
• 2.2.2.10 阳性克隆序列测定39
• 2.2.2.11 VP1序列分析39-40
• 2.2.2.12 动物回归试验40-41
• 3 结果与分析41-57
• 3.1 传代后胚体死亡规律41-42
• 3.2 DHAV-3 鸡胚传代毒的VP1序列测定42
• 3.3 阳性质粒的双酶切鉴定结果42-43
• 3.4 5株DHAV-3 病毒传代后各代次VP1蛋白克隆测序后基因及氨基酸序列比对的结果及分析43-57
• 3.4.1 1C传代后各代次VP1蛋白克隆测序后基因及氨基酸序列比对的结果及分析43-45
• 3.4.2 2C传代后各代次VP1蛋白克隆测序后基因及氨基酸序列比对的结果及分析45-47
• 3.4.3 3C传代后各代次VP1蛋白克隆测序后基因及氨基酸序列比对的结果及分析47-49
• 3.4.4 4C传代后各代次VP1蛋白克隆测序后基因及氨基酸序列比对的结果及分析49-51
• 3.4.5 5C传代后各代次VP1蛋白克隆测序后基因及氨基酸序列比对的结果及分析51-53
• 3.4.6 5株病毒之间变异情况的比较53-55
• 3.4.7 动物回归试验结果55-57
• 4 讨论57-60
• 5 结论60-61
• 6 参考文献61-69
• 7 致谢69

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