田鼠巴贝斯虫两个硫氧还蛋白基因的克隆及鉴定

发布时间：2017-08-09 21:29

  本文关键词：田鼠巴贝斯虫两个硫氧还蛋白基因的克隆及鉴定

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【摘要】：巴贝斯虫病是由巴贝斯虫寄生在宿主红细胞中引起的一种血液寄生虫病,主要通过硬蜱传播。田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)感染动物和人,主要症状为发热、头痛、疲劳、贫血等,对免疫缺陷和免疫力低下的人群具有致死性,严重危害人类健康,是一种新发蜱传疾病。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白质,它和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,Trx R)、NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统,是硫氧还蛋白系统的重要组成部分。对疟原虫等血液原虫的研究发现,它们生存依赖氧化还原系统清除体内的氧化物,硫氧还蛋白系统发挥着氧化还原调节和抗氧化防御的核心功能。目前,巴贝斯虫硫氧还蛋白系统还缺少研究。本研究旨在鉴定田鼠巴贝斯虫Trx分子,为了解巴贝斯虫的硫氧还蛋白系统分子机制,发现药物靶点提供基础。本研究结果包括以下4个方面:一、通过田鼠巴贝斯虫转录组测序,利用生物信息学软件比对分析,筛选出田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白(Trx)基因序列。通过3’和5’RACE技术克隆全长田鼠巴贝斯虫Trx-2和Trx-3基因。氨基酸序列分析显示,田鼠巴贝斯虫Trx-2和Trx-3基因都具有典型的硫氧还蛋白结构域和WCGPC活性位点。二、构建了以p ET-30a为载体的重组表达质粒,转化至BL21感受态细胞,在1m M IPTG诱导下,成功进行了重组蛋白的表达,经亲和层析纯化,获得重组蛋白。三、胰岛素还原实验显示,重组Trx-2和Trx-3蛋白都有还原活性。Trx-2还原活性随反应时间增加不断增大,4分钟后达到平稳峰值;Trx-3还原活性迅速,即刻达到平稳峰值,与阳性对照组相似。四、通过Western blot鉴定,证明虫体Trx-2和Trx-3天然蛋白的分子量大小分别为15.5k Da和21.7k Da,且虫体在红细胞中分裂高峰期时Trx-2和Trx-3大量表达。间接免疫荧光实验(IFAT)证明Trx-2和Trx-3天然蛋白主要存在于细胞浆中。综上所述,本研究克隆了田鼠巴贝斯虫Trx-2和Trx-3全长基因,完成两个重组蛋白的表达和活性分析,确定了两个分子的大小和初步定位。为阐明巴贝斯虫的硫氧还蛋白抗氧化系统分子机制和筛选新型药物靶点提供基础。
【关键词】：田鼠巴贝斯虫 硫氧还蛋白 原核表达 蛋白活性分析
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S852.7
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-9
• 第一章 综述9-16
• 1.1 原虫Trx结构9-10
• 1.2 Trx的生物活性与功能10-14
• 1.3 Trx抑制剂14-15
• 1.4 小结15-16
• 第二章 田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白基因的克隆16-39
• 2.1 引言16
• 2.2 实验材料16-17
• 2.2.1 材料16
• 2.2.2 实验仪器16-17
• 2.3 实验方法17-27
• 2.3.1 收集昆明小白鼠红细胞中的田鼠巴贝斯虫虫体17
• 2.3.2 田鼠巴贝斯虫总RNA的提取和转录组测序17-18
• 2.3.3 田鼠巴贝斯虫总RNA反转录为cDNA18
• 2.3.4 硫氧还蛋白保守片段的扩增18-21
• 2.3.5 Trx-2、Trx-3 的 3’端快速扩增21-23
• 2.3.6 Trx-2、Trx-3 的 5’端快速扩增23-26
• 2.3.7 全长基因的扩增26-27
• 2.4 实验结果27-37
• 2.4.1 总RNA的提取27-28
• 2.4.2 保守片段的扩增28-29
• 2.4.3 3’端快速扩增29-31
• 2.4.4 5’端快速扩增31-33
• 2.4.5 全长基因的扩增33-37
• 2.5 讨论37-39
• 第三章 硫氧还蛋白基因的原核表达39-53
• 3.1 引言39
• 3.2 实验材料39-40
• 3.2.1 材料39
• 3.2.2 实验仪器39-40
• 3.3 实验方法40-47
• 3.3.1 重组质粒的构建40-43
• 3.3.2 重组蛋白表达形式分析43-45
• 3.3.3 蛋白纯化及定量45-47
• 3.4 实验结果47-51
• 3.4.1 重组质粒的构建47-48
• 3.4.2 重组蛋白表达形式分析48-49
• 3.4.3 蛋白纯化及定量49-51
• 3.5 讨论51-53
• 第四章 硫氧还蛋白重组蛋白活性分析53-57
• 4.1 引言53
• 4.2 实验材料53
• 4.3 实验方法53-54
• 4.4 实验结果54-55
• 4.5 讨论55-57
• 第五章 Trx-2 和Trx-3 在虫体中天然蛋白的Western鉴定及IFAT实验57-66
• 5.1 引言57
• 5.2 实验材料57-58
• 5.2.1 材料57
• 5.2.2 实验仪器57-58
• 5.3 实验方法58-60
• 5.3.1 多抗血清的制备58
• 5.3.2 Western blot鉴定58-59
• 5.3.3 间接免疫荧光实验（IFAT）检测59-60
• 5.4 实验结果60-64
• 5.4.1 Trx-2 和Trx-3 多抗血清的Western blot鉴定60-62
• 5.4.2 His单抗的Western blot鉴定62
• 5.4.3 间接免疫荧光实验（IFAT）检测62-64
• 5.5 讨论64-66
• 第六章 全文总结66-67
• 参考文献67-73
• 附录73-81
• 作者简介81-82
• 致谢82-83

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本文编号：647441