E种肠道病毒HY12的分离鉴定与双抗体夹心ELISA检测病毒抗原方法的建立及其应用

发布时间：2017-08-10 09:29

  本文关键词：E种肠道病毒HY12的分离鉴定与双抗体夹心ELISA检测病毒抗原方法的建立及其应用

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【摘要】：牛肠道病毒感染是由牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)引起的一种临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻和繁殖障碍为主要特征的传染病,严重危害养牛业的健康发展。该病在国内为新发传染病,其发病机理、诊断方法与防治等方面缺乏研究。本研究对长春地区暴发的临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、严重腹泻、高发病率(47%)和致死率(51%)为特征的病因未明疫病进行了研究。应用病毒分离技术从腹泻病牛粪便中分离到大小20-30 nm的病毒粒子。电镜观察、理化学特性鉴定和基因组序列扩增与序列分析,确定所分离的病毒为牛肠道病毒(BEV),命名为HY12毒株。与其它报道的牛肠道病毒不同,HY12毒株具有很高的感染性,TCID50高达10-11/0.1 mL。核苷酸序列分析结果表明,HY12毒株与国外分离的牛肠道病毒株SL305的同源性高达90%,而与国内分离的毒株同源性只有75%。进化树分析发现,HY12毒株属于肠道病毒属的E种肠道病毒。这是国内分离出的首株E种肠道病毒。应用分子生物学技术,扩增、克隆和表达了HY12编码的结构蛋白VP1和VP2基因,制备出针对VP1和VP2蛋白的多克隆抗抗体和单克隆抗体,并建立了检测BEV病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法,同时对吉林省不同地区的牛群感染BEV进行了病原流行病学调查。方阵法确定了抗VP1鼠源IgG的最佳包被量为0.75μg/孔,酶标抗体的最佳稀释度为1:3 600。检测大量阴性粪便样品及统计学处理,确定了夹心ELISA检测BEV的判定标准:当被检样品OD490值≥0.145时,样品判定为阳性。与病毒分离试验和RT-PCR方法进行比较,建立的检测BEV抗原的双抗体夹心ELISA方法具有特异、敏感、快速、操作简便和易在基层推广应用等特点。应用建立的双抗体夹心ELISA方法,检测了吉林省不同地区牛群肠道病毒的感染情况,发现不同地区BEV感染率高达8.16%-58.7%,该结果将为今后本病的防治提供流行病学的理论依据。
【关键词】：牛肠道病毒 HY12 原核表达 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA 流行病学调查
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文缩略词11-12
• 引言12-13
• 第一章 文献综述13-21
• 1 病原学概况13-16
• 2 BEV流行病学研究16-19
• 3 BEV感染的诊断研究19-21
• 第二章 牛肠道病毒（HY12）的分离与鉴定21-34
• 2.1 材料21-22
• 2.2 方法22-26
• 2.3 结果26-31
• 2.4 讨论31-33
• 2.5 小结33-34
• 第三章 HY12结构蛋白基因VP1和VP2的原核表达与纯化34-51
• 3.1 材料34-37
• 3.2 方法37-45
• 3.3 结果45-49
• 3.4 讨论49-50
• 3.5 小结50-51
• 第四章 抗VP1和VP2抗体制备与纯化51-63
• 4.1 材料51-53
• 4.2 方法53-58
• 4.3 结果58-61
• 4.4 讨论61-62
• 4.5 小结62-63
• 第五章 双抗体夹心ELISA方法的建立与吉林省BEV流行病学调查63-71
• 5.1 材料63-64
• 5.2 方法64-65
• 5.3 结果65-68
• 5.4 讨论68-70
• 5.5 小结70-71
• 结论71-72
• 参考文献72-80
• 导师简介80-81
• 作者简介81-83
• 致谢83

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本文编号：649979