甘氨酰tRNA合成酶对奶牛乳腺上皮细胞乳合成及细胞增殖的影响

发布时间：2017-08-11 12:28

  本文关键词：甘氨酰tRNA合成酶对奶牛乳腺上皮细胞乳合成及细胞增殖的影响

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【摘要】：随着人们对食品安全认识的不断加深,使得乳品质的好坏和产奶量的高低得到更广泛的关注。研究泌乳相关信号通路,探寻与泌乳相关的重要调控分子,有利于为奶牛乳品质和乳产量的提高,提供实验依据及新途径。甘氨酰tRNA合成酶(glycyl-t RNA synthetase,GlyRS)是重要的氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-t RNA synthetases,aa RSs)家族成员。研究发现aa RSs存在多种经典翻译功能之外的信号调控作用。但是,目前国内外关于GlyRS在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究尚未见报道。本实验室前期发现GlyRS与BMECs乳蛋白的合成有关。本实验旨在阐明GlyRS对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)乳蛋白、乳脂、乳糖以及细胞增殖的影响。从而初步揭示GlyRS是一个新的调节BMECs乳合成的信号分子。本研究采用了组织块培养法,体外培养并得到了纯化的BMECs。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)和蛋白质免疫印记(western blotting,WB)检测细胞中角蛋18(CK18)和β-Casein(CSN2)的表达,以鉴定细胞的纯度和泌乳功能。实验通过在细胞培养液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸(methionine,Met)或10%的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)建立一个体外细胞培养的泌乳模型。采用WB、IF以及实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)等方法,检测添加Met或FBS后,乳糖和乳脂(triglyceride,TG)的分泌量,DNA数量,CSN2、GlyRS、p-GlyRS(T544,S704)的表达量以及p-GlyRS(T544,S704)的定位情况。结果表明,添加Met或FBS可以促进细胞乳糖和乳脂的分泌(p0.05),增加DNA合成,显著提高CSN2、GlyRS以及p-GlyRS(T544,S704)的表达量(p0.05),同时发现p-GlyRS(T544,S704)在细胞核中定位明显增加。这表明,在Met或FBS可以通过GlyRS调节BMECs乳合成以及细胞增殖。利用纯化后的BMECs分别建立GlyRS过表达(pGCMV-IRES-EGFP-GlyRS)与干扰(GlyRS shRNA)的细胞泌乳模型,采用WB、IF、qRT-PCR和流式细胞术(flow cytometry,FCM)等方法,检测乳糖和乳脂的分泌量,DNA数量,细胞周期的分布以及GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、SREBP-1、CSN2、Cyclin D1和β-1,4-galactosyltransferase2(β4Gal-T2)的表达。结果表明,当GlyRS过表达和抑制时,乳糖和乳脂的分泌量,细胞的DNA合成,处于S期和G2/M期的细胞数分别显著增加和降低(p0.05)。同时,GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-Gly RS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1和CSN2的蛋白表达水平以及β4Gal-T2的mRNA表达量也均显著增加和降低(p0.05)。然而,mTOR和S6K1的蛋白表达水平无显著变化(p0.05)。这表明,GlyRS通过上调p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1以及β4Gal-T2的表达量,促进乳蛋白、乳脂以及乳糖的合成,同时提高BMECs增殖能力。综上所述,GlyRS作为一个重要的信号分子,能接受营养物质(如Met,FBS)信号,正向调节BMECs的乳合成以及细胞增殖。其可能的调控机制如下:当GlyRS接受Met或FBS刺激后,其磷酸化蛋白水平增加,进入细胞核量增多,通过上调p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、β4Gal-T2以及Cyclin D1的表达,促进BMECs乳合成以及细胞增殖。
【关键词】：奶牛乳腺上皮细胞 甘氨酰tRNA合成酶 乳合成 细胞增殖
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 引言14-22
• 1.1 乳腺上皮细胞乳合成和细胞增殖的基本规律14-15
• 1.1.1 乳蛋白的合成14
• 1.1.2 乳脂合成14
• 1.1.3 乳糖合成14-15
• 1.1.4 MECs的增殖15
• 1.2 调控BMECs乳合成的细胞信号转导途径15-19
• 1.2.1 mTOR途径对乳蛋白和乳脂合成的调控15-16
• 1.2.2 SREBP-1 途径对乳脂合成的调控16-17
• 1.2.3 β4GalT对乳糖合成的调控17
• 1.2.4 Cyclin D1对MECs增殖的调控17
• 1.2.5 外源激素、生长因子和营养素对乳合成和细胞增殖的调控17-19
• 1.3 氨基酰tRNA合成酶19-20
• 1.3.1 氨基酰tRNA合成酶的基本结构19
• 1.3.2 aaRSs的非经典功能19-20
• 1.3.3 甘氨酰tRNA合成酶的非经典功能20
• 1.4 实验的目的与意义20-22
• 2 材料与方法22-35
• 2.1 实验材料22-25
• 2.1.1 主要实验试剂22-23
• 2.1.2 主要实验仪器23
• 2.1.3 实验动物与细胞23-24
• 2.1.4 试剂的配制24-25
• 2.2 实验方法与步骤25-35
• 2.2.1 BMECs的原代培养与纯化25-26
• 2.2.2 BMECs的鉴定26-28
• 2.2.3 添加Met、FBS的BMECs泌乳模型的建立28
• 2.2.4 过表达GlyRS的BMECs泌乳模型的建立28-29
• 2.2.5 抑制GlyRS的BMECs泌乳模型的建立29-32
• 2.2.6 添加Met、FBS后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响32-33
• 2.2.7 GlyRS过表达后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响33-34
• 2.2.8 GlyRS抑制后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响34
• 2.2.9 数据处理34-35
• 3 结果与分析35-54
• 3.1 BMECs的原代培养35-36
• 3.2 加Met、FBS后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响36-42
• 3.2.1 加Met、FBS后对BMECs乳糖分泌的影响36-37
• 3.2.2 加Met、FBS后对BMECs TG分泌的影响37-38
• 3.2.3 加Met、FBS后对BMECs增殖的影响38-39
• 3.2.4 Met、FBS调节BMECs中相关基因的表达39-40
• 3.2.5 加Met、FBS后对p-GlyRS核定位的影响40-42
• 3.3 GlyRS过表达后可上调BMECs的乳合成及细胞增殖42-46
• 3.3.1 GlyRS过表达后增加BMECs乳糖的分泌42
• 3.3.2 GlyRS过表达后增加BMECsTG的分泌42-43
• 3.3.3 GlyRS过表达后促进DNA合成及加快细胞周期转换43-45
• 3.3.4 GlyRS过表达后增加β4Gal-T2的mRNA表达量45
• 3.3.5 GlyRS过表达后增加相关蛋白的表达45-46
• 3.4 GlyRS抑制后可下调BMECs的乳合成及细胞增殖46-54
• 3.4.1 GlyRS干扰片段的筛选46-48
• 3.4.2 GlyRS抑制后减少BMECs乳糖的分泌48-49
• 3.4.3 GlyRS抑制后减少BMECs 中TG的分泌49-50
• 3.4.4 GlyRS抑制后减少DNA合成及减缓细胞周期转换50-52
• 3.4.5 GlyRS抑制后降低β4Gal-T2的mRNA表达量52
• 3.4.6 GlyRS抑制后降低相关蛋白水平的表达52-54
• 4 讨论54-59
• 4.1 BMECs的原代培养、纯化及鉴定54
• 4.2 Met和FBS对BMECs乳合成及细胞增殖的影响54-56
• 4.2.1 Met和FBS对乳蛋白、乳脂及乳糖合成的影响54-55
• 4.2.2 Met和FBS对BMECs增殖能力的影响55
• 4.2.3 Met和FBS对GlyRS表达的影响55
• 4.2.4 Met和FBS对p-GlyRS表达及入核的影响55-56
• 4.3 GlyRS对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响56-59
• 4.3.1 GlyRS对BMECs乳蛋白合成的影响56
• 4.3.2 GlyRS对BMECs乳脂合成的影响56
• 4.3.3 GlyRS对BMECs乳糖合成的影响56-57
• 4.3.4 GlyRS过表达与抑制对p-GlyRS表达的影响57
• 4.3.5 GlyRS对细胞增殖的影响57-59
• 5 结论59-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-68
• 附录68-70
• 攻读硕士学位期间发表学术论文70

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本文编号：656127