猪带绦虫HSP70-4真核表达及其免疫佐剂效应研究

发布时间：2017-08-15 05:13

  本文关键词：猪带绦虫HSP70-4真核表达及其免疫佐剂效应研究

  更多相关文章： 猪带绦虫 猪囊尾蚴病 HSP70-4 真核表达 免疫佐剂

【摘要】：猪囊尾蚴病是猪带绦虫的幼虫—囊尾蚴所引起的一种重要的人畜共患寄生虫病,被世界卫生组织列为17种最易被忽略的热带病之一。该病呈世界性分布,不仅给养殖业造成了巨大的损失,同时还威胁着人类的身体健康。虽然广谱抗蠕虫药吡喹酮、丙硫咪唑对猪囊尾蚴病有一定的治疗效果,但其副作用严重,长期使用还会产生耐药性。因此,疫苗的研究显得尤为重要。猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白作为主要的候选抗原之一,具有较好的免疫保护力,但稳定性较差,分子量小(仅为16ku),对其免疫效果造成了一定影响。热休克蛋白70(Heat shock Protein70,HSP70)是一类在结构和功能上高度保守的蛋白,具有分子伴侣、抗原递呈、抗感染免疫、抑制细胞凋亡等作用,现已被广泛用作佐剂或抗原载体来增强疫苗的免疫保护力。为了提高猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白的稳定性以及免疫保护力,我们开展了将猪带绦虫HSP70-4(TsHSP70-4)作为免疫佐剂的研究,目的是为猪带绦虫基因工程疫苗免疫佐剂的选择提供新的思路。研究取得了如下结果:1.参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,设计特异性引物,RT-PCR获得TsHSP70-4 ORF序列,全长为1953bp。根据毕赤酵母密码子偏好性,对TsHSP70-4基因密码子进行优化,连接载体pPIC9K,在毕赤酵母中进行高效表达,获得大小约为95kD的重组蛋白。Western-blot检测及质谱分析表明,获得的重组蛋白即为TsHSP70-4。2.将TsHSP70-4用柔性linker与猪带绦虫六钩蚴TSOL18的N端相连,在毕赤酵母中诱导表达,获得了大小约为115kD的融合蛋白TsHSP70-4-TSOL18。3.以TsHSP70-4作为佐剂,与TSOL18混合免疫(即TsHSP70-4+TSOL18免疫组)可以延长其在小鼠体内的作用时间;在免疫的第18天,该免疫组小鼠血清中IL-4、IFN-γ的浓度与TSOL18免疫组相比较,存在显著提高(P0.05);在第21天,该免疫组小鼠血清中IL-10的浓度与TSOL18免疫组比较,有明显增强(P0.01);在第21天和第28天,对全血T淋巴细胞亚群测定分析,该免疫组CD3+CD4+的百分率均有显著提高(P0.05)。由此可知,TsHSP70-4与TSOL18混合免疫,可以延长TSOL18在体内的滞留时间,增强机体的免疫应答能力,特别是体液免疫水平。4.用TsHSP70-4-TSOL18融合蛋白免疫小鼠,获得的免疫效果远低于TsHSP70-4+TSOL18免疫组和TSOL18免疫组。综合上述,TsHSP70-4可以作为TSOL18重组蛋白潜在的免疫佐剂。TsHSP70-4-TSOL18融合蛋白免疫效果较差,推测可能与融合的方向和方式有关,具体原因有待进一步研究。
【关键词】：猪带绦虫 猪囊尾蚴病 HSP70-4 真核表达 免疫佐剂
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.734
【目录】：

• 摘要5-6
• abstract6-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 猪带绦虫概述12-14
• 1.1.1 猪带绦虫及猪囊尾蚴病12
• 1.1.2 猪囊尾蚴病免疫学诊断的研究进展12-13
• 1.1.3 猪囊尾蚴病的治疗与预防13-14
• 1.2 热休克蛋白70概述14-19
• 1.2.1 热休克蛋白发现及分类14
• 1.2.2 HSP70家族的结构特征及分类14-15
• 1.2.3 HSP70的生物学功能15-17
• 1.2.4 HSP70在寄生虫中的研究进展17-19
• 1.3 研究目的与意义19-20
• 第二章 TsHSP70-4 基因克隆及序列分析20-27
• 2.1 材料与方法20-21
• 2.1.1 虫株、菌株及试剂20
• 2.1.2 主要仪器20
• 2.1.3 引物的设计与合成20
• 2.1.4 猪带绦虫总RNA的提取20-21
• 2.1.5 c DNA的合成21
• 2.1.6 TsHSP70-4 基因的扩增21
• 2.1.7 TsHSP70-4 生物信息学分析21
• 2.2 实验结果21-26
• 2.2.1 总RNA的提取21-22
• 2.2.2 TsHSP70-4 基因的扩增与测序22-23
• 2.2.3 TsHSP70-4 生物信息学分析23-26
• 2.3 讨论26-27
• 第三章 TsHSP70-4 真核表达27-33
• 3.1 材料与方法27-29
• 3.1.1 载体、菌株与试剂27
• 3.1.2 主要仪器27
• 3.1.3 重组质粒p PIC9K-TsHSP70-4 的构建27-28
• 3.1.4 重组质粒p PIC9K-TsHSP70-4 线性化28
• 3.1.5 酵母感受态细胞的制备28
• 3.1.6 电击转化与菌落筛选28-29
• 3.1.7 TsHSP70-4 重组蛋白的诱导表达29
• 3.1.8 TsHSP70-4 重组蛋白的纯化与鉴定29
• 3.2 实验结果29-32
• 3.2.1 重组质粒p PIC9K-TsHSP70-4 线性化29-30
• 3.2.2 TsHSP70-4 重组蛋白的诱导表达30-31
• 3.2.3 TsHSP70-4 重组蛋白的纯化31
• 3.2.4 纯化后的TsHSP70-4 的Western-blot及质谱鉴定31-32
• 3.3 讨论32-33
• 第四章 TsHSP704TSOL18真核表达33-39
• 4.1 材料与方法33-34
• 4.1.1 载体、菌株与试剂33
• 4.1.2 主要仪器33
• 4.1.3 重组质粒p PIC9K-TsHSP704TSOL18的构建33
• 4.1.4 重组质粒p PIC9K-TsHSP704TSOL18线性化33-34
• 4.1.5 酵母感受态细胞的制备34
• 4.1.6 电击转化与菌落筛选34
• 4.1.7 TsHSP704TSOL18重组蛋白的诱导表达34
• 4.1.8 TsHSP704TSOL18重组蛋白的纯化与鉴定34
• 4.2 实验结果34-37
• 4.2.1 重组质粒p PIC9K-TsHSP704TSOL18线性化34-35
• 4.2.2 TsHSP704TSOL18重组蛋白的诱导表达35-36
• 4.2.3 TsHSP704TSOL18重组蛋白的纯化36
• 4.2.4 TsHSP704TSOL18重组蛋白的Western-blot鉴定36-37
• 4.3 讨论37-39
• 第五章 TsHSP70-4 的免疫佐剂效应39-47
• 5.1 材料与方法39-41
• 5.1.1 主要试剂39
• 5.1.2 主要仪器39
• 5.1.3 实验动物39
• 5.1.4 实验小鼠分组39-40
• 5.1.5 实验小鼠免疫与采血40
• 5.1.6 实验小鼠血清TSOL18抗体的检测40-41
• 5.1.7 实验小鼠IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 的检测41
• 5.1.8 实验小鼠全血T淋巴细胞亚群的测定41
• 5.2 实验结果41-45
• 5.2.1 实验小鼠血清TSOL18抗体的检测41-42
• 5.2.2 实验小鼠IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 的检测42-44
• 5.2.3 实验小鼠全血T淋巴细胞亚群的测定44-45
• 5.3 讨论45-47
• 第六章 全文结论47-48
• 参考文献48-53
• 致谢53-54
• 作者简历54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 赵莉;石保新;李军;张壮志;马正海;张旭;薛晶;金映红;张文宝;;细粒棘球蚴原头蚴包囊和原头蚴成虫抑制差减杂交文库中差异表达基因的筛选及分析[J];畜牧兽医学报;2015年07期

2 黄琼;胡杰;孙灵;王勤;;黄粉虫热休克蛋白70基因的克隆、序列分析与表达(英文)[J];昆虫学报;2013年05期

3 张良杰;赵守松;;囊虫病的免疫学特点及免疫学诊断技术进展[J];中国病原生物学杂志;2013年03期

4 殷丽天;申金雁;孟晓丽;王海龙;刘红丽;殷国荣;;重组弓形虫热休克蛋白70不同途径免疫小鼠诱导的小肠黏膜IgA抗体分泌细胞及sIgA抗体的动态变化[J];中国生物制品学杂志;2013年02期

5 宇芙蓉;;猪囊尾蚴病免疫学诊断方法的研究进展(综述)[J];安徽卫生职业技术学院学报;2012年03期

6 杨洁;杨琳琳;孙希;郑焕钦;吕志跃;吴忠道;;日本血吸虫热休克蛋白70诱导BALB/c小鼠皮肤炎症反应的实验研究[J];中国血吸虫病防治杂志;2012年01期

7 王晓婷,朱荫昌;热休克蛋白及其在血吸虫研究中的进展[J];中国血吸虫病防治杂志;2005年03期

8 蔡娟;汪学龙;沈继龙;;猪囊尾蚴病免疫诊断研究与进展[J];热带病与寄生虫学;2004年02期

9 吴丹,王庆敏,陈蕊雯,朱维佳,陈祖欢,孙树汉;猪囊尾蚴抗原cC1 DNA疫苗和蛋白质疫苗联合诱导小鼠免疫应答[J];第二军医大学学报;2004年01期

10 谭红梅,吴伟康;HSP70调节应激活化蛋白激酶JNK活性与细胞凋亡[J];中国病理生理杂志;2001年05期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 才学鹏;;猪带绦虫基因工程疫苗的研究进展[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 丁军涛;表达Tsol18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建及其免疫学研究[D];中国农业科学院;2008年

2 葛菲菲;结核杆菌hsp70在乙脑基因工程疫苗研制中的免疫增强作用[D];南京农业大学;2006年

3 骆学农;猪带绦虫六钩蚴45W-4B和TSO18重组基因工程疫苗的研究[D];中国农业科学院;2005年

4 袁改玲;猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组基因工程疫苗的研制[D];中国农业科学院;2005年

，

本文编号：676401