基于密码子优化的VP1基因表达蛋白检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体的胶体金试纸条

发布时间：2017-08-17 02:21

  本文关键词：基于密码子优化的VP1基因表达蛋白检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体的胶体金试纸条

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【摘要】：鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)引起的鸭病毒性肝炎主要侵害3周龄以下雏鸭,死亡率高达90%以上。VP1蛋白位于DHAV衣壳表面,是其主要的结构蛋白之一,也是病毒粒子抗原性的主要组成部分。已有研究资料表明,1型和3型鸭甲肝病毒(DHAV-1和DHAV-3)存在抗原交叉,为建立简单快速的检测DHAV-1和DHAV-3抗体的方法,本研究对DHAV-1 X株的结构蛋白VP1基因进行密码子优化后克隆到pET-28a(+)载体中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/optiVP1并进行原核表达,纯化表达蛋白,开展了基于密码子优化型VP1重组蛋白的检测DHAV-1和DHAV-3抗体的胶体金免疫层析试纸条的研制等一系列研究,主要结果如下：1. DHAV-1 VP1基因稀有密码子及抗原表位分析通过生物信息学在线网站分析1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)X株VP1基因稀有密码子情况和抗原表位,发现VP1中含26个稀有密码子,稀有密码子含量较多,且存在五处连续稀有密码子,1-72位氨基酸序列和83-238位氨基酸序抗原表位较丰富。并根据大肠杆菌密码子偏嗜性对VP1密码子进行改造,人工合成密码子优化型VP1 (optiVP1)基因。2.VP1和optiVP1基因克隆表达、鉴定及纯化通过RT-PCR扩增了预期大小的DHAV-1-X VP1全基因序列,将目的片段VP1和optiVP1分别克隆至pET-28a(+)上,构建两种原核表达质粒pET-28a (+)/VP1和pET-28a (+)/optiVP1并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行原核表达。结果表明,只有optiVPl成功表达,在0.4 mmol/LIPTG、37℃诱导12h的表达量最大,表达的重组蛋白大小约为32 kDa,以包涵体的形式存在。采用切胶回收方法获得纯度较高的重组蛋白,Western blot分析结果表明该蛋白可被兔抗DHAV-1抗体和兔抗DHAV-3抗体识别,具有良好的反应原性。3. optiVPl多克隆抗体的制备用纯化的optiVP1蛋白免疫昆明鼠,制备的鼠抗optiVP1高免血清的间接ELISA效价达到1：51200,间接免疫荧光试验证实该鼠抗optiVP1血清能识别DHAV-1和DHAV-3,表明optiVP1具有良好的免疫原性。4. 检测DHAV抗体的金标试纸条的研制及应用以optiVP1蛋白为抗原制备了双抗原夹心法(ICS-SM)和间接法(ICS-ID)检测DHAV抗体的胶体金免疫层析试纸条,特异性试验结果表明制备的金标试纸条能够检测DHAV-1抗体和DHAV-3抗体,对鸭疫里默氏菌(RA)、鸭瘟、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌等鸭常见病的阳性血清检测结果为阴性,特异性好。敏感性试验结果表明,当DHAV-1阳性血清作1：64稀释时,检测结果仍呈阳性；当DHAV-3阳性血清作1：32稀释时,检测结果仍呈阳性。对16份临床鸭血清样本的检测限度结果表明双抗原夹心法试纸条的灵敏度与中和试验相当甚至高于中和试验,间接法试纸条敏感性与中和试验相当。双抗原夹心法试纸条和间接法试纸条与间接ELISA方法检测结果的符合率分别为82.3%(93/113)和85.8%(97/113),与中和试验的符合率均为100%(16/16)。制备的双抗原夹心法试纸条和间接法试纸条稳定性好,可在4℃至少保存6个月。
【关键词】：DHAV-1和DHAV-3 密码子优化的VP1蛋白 胶体金免疫层析试纸条
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 部分缩写词及符号说明表7-12
• 一、文献综述12-19
• 1 鸭甲肝病毒(DHAV)概述12-13
• 1.1 DHAV的病原学特性12
• 1.2 DHAV的分子生物学特征12-13
• 2 DHAV VP1基因及VP1蛋白的研究进展13-14
• 3 鸭甲肝病毒病原和抗体的诊断方法14-16
• 3.1 根据临床症状和病理剖检病变诊断14-15
• 3.2 血清学诊断15-16
• 3.3 分子生物学诊断16
• 4 免疫胶体金技术16-18
• 4.1 基本原理17
• 4.2 应用及发展前景17-18
• 5 选题目的及意义18-19
• 二、试验研究19-57
• 1 材料19-22
• 1.1 毒株、菌种、血清和试验动物19
• 1.2 主要试剂19-20
• 1.3 其他试验材料20
• 1.4 常用试剂的配制20-22
• 2 主要仪器设备22
• 3 试验方法22-33
• 3.1 VP1基因和optiVP1的克隆、表达及纯化22-27
• 3.1.1 VP1密码子偏嗜性及抗原表位分析22
• 3.1.2 VP1密码子优化及基因合成22-23
• 3.1.3 引物设计23
• 3.1.4 病毒总RNA的提取23
• 3.1.5 VP1基因的RT-PCR扩增23-24
• 3.1.6 VP1基因的T克隆24
• 3.1.7 原核重组表达质粒的构建24-25
• 3.1.8 目的蛋白的表达及纯化25-27
• 3.2 鼠抗optiVP1蛋白血清的制备及应用27-28
• 3.2.1 鼠抗重组蛋白高免血清的制备27
• 3.2.2 基于鼠抗optiVP1血清的间接免疫荧光检测DHAV-1和DHAV-327-28
• 3.3 胶体金免疫层析试纸条的研制28-31
• 3.3.1 抗原夹心法试纸条的研制28-30
• 3.3.2 间接法试纸条的研制30
• 3.3.3 试纸条性能评估30-31
• 3.4 间接ELISA检测DHAV抗体31-32
• 3.4.1 DHAV-1的增殖及纯化31
• 3.4.2 间接ELISA检测DHAV抗体31-32
• 3.4.3 临界值的确定32
• 3.4.4 特异性试验32
• 3.4.5 间接ELISA与金标试纸条符合率的评估32
• 3.5 中和试验检测DHAV抗体32-33
• 3.5.1 病毒TCID_(50)的测定32-33
• 3.5.2 中和效价的测定33
• 3.5.3 中和试验与金标试纸条灵敏度和符合率的比较33
• 4 试验结果33-57
• 4.1 VP1密码子偏嗜性分析及VP1密码子优化33-35
• 4.1.1 VP1密码子偏嗜性及抗原表位分析33-34
• 4.1.2 VP1密码子优化34-35
• 4.2 VP1和optiVP1的克隆表达、鉴定及纯化35-40
• 4.2.1 VP1的PCR扩增35-36
• 4.2.2 VP1基因的T克隆36-37
• 4.2.3 VP1和optiVP1基因的亚克隆37
• 4.2.4 重组蛋白的表达37-39
• 4.2.5 重组蛋白optiVP1的纯化39-40
• 4.3 鼠抗optiVP1蛋白血清的制备及运用40-41
• 4.3.1 鼠抗optiVP1蛋白血清效价的测定40
• 4.3.2 基于鼠抗optiVP1抗体的间接免疫荧光检测DHAV-1和DHAV-340-41
• 4.4 胶体金免疫层析试纸条的研制41-51
• 4.4.1 双抗原夹心法试纸条的研制41-46
• 4.4.2 间接法试纸条的研制46-47
• 4.4.3 试纸条性能评价47-51
• 4.5 间接ELISA检测DHAV抗体51-55
• 4.5.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的摸索51-52
• 4.5.2 酶标二抗的最佳稀释度52-53
• 4.5.3 抗原的包被条件的优化53
• 4.5.4 临界值的确定53-54
• 4.5.5 特异性试验54
• 4.5.6 胶体金试纸条和间接ELISA符合率的评估54-55
• 4.6 中和试验检测DHAV抗体55-57
• 4.6.1 病毒TCID_(50)的测定55-56
• 4.6.2 中和效价的测定56
• 4.6.3 中和试验与金标试纸条灵敏度和符合率的比较56-57
• 三、讨论57-62
• 1 optiVP1蛋白的原核表达、纯化及活性分析57-58
• 2 双抗原夹心法与间接法试纸条检测DHAV抗体的优缺点58-59
• 3 试纸条的保存及耗材的筛选59
• 4 基于optiVP1蛋白的胶体金试纸条的研制59-62
• 四、结论62-63
• 参考文献63-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：686694