羊流产衣原体细胞灭活疫苗的研究

发布时间：2017-08-17 05:27

  本文关键词：羊流产衣原体细胞灭活疫苗的研究

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【摘要】：流产衣原体(Chlamydia abortus)是专性细胞内寄生的、革兰氏阴性细菌。流产衣原体是羊地方性流产(ovine enzootic abortion,OEA)的病原,能引起猪、牛等多种脊椎动物在妊娠晚期发生流产,主要寄生于这些动物生殖道黏膜表面的上皮细胞内,造成生殖道黏膜损伤,导致母畜流产、产死胎、弱胎等,引发公畜睾丸炎、包皮炎、尿道炎等,偶尔也会感染妊娠妇女,引起急性感染或流产。所以,流产衣原体也是一种人兽共患病病原,其防控研究具有重要的公共卫生及经济意义。本研究利用接种鸡胚卵黄囊的方法从甘肃省肃南县分离到一株羊衣原体,根据Gen Bank公布的流产衣原体helicase gene clone 8的核苷酸序列,设计衣原体helicase gene clone 8的引物,参考相关文献,进行了PCR-RFLP试验,PCR产物经Alu I酶切后原本479 bp大小的基因被切为两个小片段,与S26/3流产衣原体标准株一致,由此可鉴定为流产衣原体。本研究采用了Hela细胞、BHK细胞、L929细胞、Mc Coy细胞这四种细胞,分别接种分离到的羊流产衣原体进行培养,通过Giemsa染色的方法观察不同细胞的感染率,选出对羊流产衣原体最为敏感的细胞为Hela细胞,进行了衣原体的扩大培养,收集的衣原体滴度测定为1.2735×105 IFU/m L,并利用电子显微镜观察流产衣原体的形态,可以看到呈球形或椭球形的、小而致密的颗粒结构为原体(Elementary body,EB),直径为0.2~0.5μm,另一种具有大而疏松的结构为网状体(Reticulate body,RB),直径为0.6~1.5μm。本研究进行了羊流产衣原体细胞灭活苗的研究,主要从灭活剂和佐剂的筛选方面展开,以Balb/c小鼠为实验动物,进行免疫,最终选择了以甲醛灭活、206+CpG为佐剂制备羊流产衣原体细胞灭活苗。免疫组小鼠血清抗体IHA检测效价达到1:65536;抗体亚型的测定结果为IgG1型,轻链主要为κ链;免疫组小鼠血清以及淋巴细胞培养上清中的IFN-γ含量均比生理盐水对照组的高;迟发型超敏反应(DTH)检测免疫组小鼠足垫增厚厚度显著大于生理盐水组;淋巴细胞增殖试验中C.abortus刺激孔的淋巴细胞增殖比刀豆球蛋白(Con A)刺激孔和阴性对照孔都显著;中和试验中免疫组血清中和后的C.abortus接种细胞形成的包涵体数量远远小于生理盐水组的IFU数量;攻毒试验中生理盐水组小鼠的脾脏重量明显大于免疫组小鼠脾脏、免疫组DNA扩增阴性,有效抵抗C.abortus的侵袭。这些评价指标的结果表明机体在接种了该疫苗以后,诱导产生特异性免疫应答,包括Th1型细胞免疫应答和Th2型体液免疫应答。综上所述,本研究成功分离培养了羊流产衣原体,并完成了在Hela细胞内的适应性培养,另外,以甲醛灭活、206+Cp G为佐剂制备的羊流产衣原体细胞灭活苗,具有良好的免疫效果,为羊流产衣原体细胞培养灭活疫苗的制备提供一个新的方法。
【关键词】：流产衣原体 适应性培养 灭活疫苗 灭活剂 佐剂
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 英文缩略表10-12
• 第一章 引言12-17
• 1.1 衣原体概述12
• 1.2 衣原体疫苗的研究进展12-16
• 1.2.1 灭活与减毒活疫苗12-13
• 1.2.2 亚单位疫苗13
• 1.2.3 核酸疫苗13-14
• 1.2.4 其他衣原体疫苗14-16
• 1.3 本研究目的和意义16-17
• 第二章 羊流产衣原体的分离鉴定17-24
• 2.1 引言17
• 2.2 材料与方法17-21
• 2.2.1 材料17-18
• 2.2.2 方法18-21
• 2.3 结果与分析21-22
• 2.3.1 病原鸡胚分离的结果21
• 2.3.2 helicase gene clone 8 的 PCR 扩增结果21-22
• 2.3.3 helicase gene clone 8 的 RFLP 结果22
• 2.4 讨论22-24
• 第三章 羊流产衣原体细胞适应株的培育及纯化24-32
• 3.1 引言24
• 3.2 材料与方法24-27
• 3.2.1 材料24-25
• 3.2.2 方法25-27
• 3.3 结果与分析27-30
• 3.3.1 羊流产衣原体在不同细胞的增殖情况27-28
• 3.3.2 间接免疫荧光法检测羊流产衣原体在Hela细胞中的增殖情况28
• 3.3.3 羊流产衣原体滴度测定结果28-29
• 3.3.4 透射电镜结果29-30
• 3.3.5 扫描电镜结果30
• 3.4 讨论30-32
• 第四章 羊流产衣原体细胞灭活疫苗的研究32-45
• 4.1 引言32
• 4.2 材料与方法32-38
• 4.2.1 材料32-34
• 4.2.2 方法34-38
• 4.3 结果与分析38-42
• 4.3.1 灭活效果38
• 4.3.2 灭活试验各组小鼠血清抗体IHA检测结果38-39
• 4.3.3 佐剂试验小鼠血清抗体IHA检测结果39
• 4.3.4 疫苗效果评价39-42
• 4.4 讨论42-45
• 4.4.1 关于灭活剂42-43
• 4.4.2 关于佐剂43
• 4.4.3 关于免疫效果评价43-45
• 第五章 全文结论45-46
• 参考文献46-51
• 附录51-52
• 致谢52-53
• 作者简介53

【参考文献】

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1 梁明星;陈超群;吴移谋;;衣原体疫苗的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2016年01期

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6 谢昌元;王光华;李明录;王顺林;韩，

本文编号：687351