鸡堆型艾美耳球虫Rhomboid增强型核酸疫苗构建及免疫保护作用

发布时间：2017-08-18 07:25

  本文关键词：鸡堆型艾美耳球虫Rhomboid增强型核酸疫苗构建及免疫保护作用

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【摘要】：鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳球虫属7种球虫引起的肠道寄生虫疾病,其中堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)是其主要病原之一。鸡球虫子孢子入侵到肠道上皮细胞并增殖使其严重受损从而导致饲料转化率降低、增重降低,这给养禽生产业造成极大的损失。过去,鸡球虫病主要靠药物防治,但是由此引发球虫耐药株的产生和药物残留等严重问题,现在球虫疫苗免疫防治逐渐替代药物防治,其中筛选有效的免疫抗原是制备高效新型球虫疫苗的基础和关键。Rhomboid属于广泛分布的丝氨酸蛋白酶家族,在球虫发育和信号转导中执行各种各样功能,特别是在球虫入侵过程中发挥着重要的作用,可能是其潜在的免疫性抗原。根据GenBank柔嫩艾美耳球虫Rhomboid基因序列(DQ323509.1)设计特异性引物,以堆型艾美耳球虫c DNA为模板PCR扩增包含Rhomboid基因ORF片段。抗原表位分析后设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接于pGEX-6p-1原核表达载体并成功构建重组质粒pGEX-Rhomboid。将此质粒转入E.coli Rosetta中IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有36 ku预期蛋白表达。纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗Rhomboid多抗。ELISA检测多抗效价达216,Western-blot检测表明制备的多抗具有良好的反应性和特异性。本试验同时构建pc DNA-Rhomboid及pc DNA-IFN-γ-Rhomboid重组真核表达质粒,体外瞬时转染表明Rhomboid及IFN-γ均可在BHK21细胞内表达,可用作免疫动物DNA疫苗使用。试验雏鸡分为5组,分别为两个真核质粒免疫组即pc DNA-Rhomboid质粒免疫组(Rho组)和pc DNA-IFN-γ-Rhomboid质粒免疫组(IFN-γ-Rho组),两个攻虫对照组即PBS注射攻虫组(PBS组)和pc DNA3.1空白质粒注射组(pc DNA组)和不攻虫对照组(Control组)。在14及21日龄时,除Control组每只鸡分别胸部肌肉注射100μL PBS或100μg pc DNA3.1、pc DNA-Rhomboid或pc DNA-IFN-γ-Rhomboid,在28日龄时,感染组雏鸡口服接种孢子化卵囊1×105个。分别在14、21、28、35及42日龄时,检测每组雏鸡淋巴细胞增殖功能、血清中抗Rhomboid IgG抗体变化及体增重变化,35日龄时,检测各组的十二指肠病变计分、克粪便卵囊数量(OPG)值并计算抗球虫指数(ACI)。结果表明,Rho组与IFN-γ-Rho组的淋巴细胞增殖活性及特异性IgG抗体随着免疫次数增加显著或极显著高于对照组;Rho组与IFN-γ-Rho组ACI分别为166.35和172.40,起到较好的抗球虫保护作用。综上,Rhomboid可以作为一种抗球虫的潜在候选基因,鸡IFN-γ可以起到免疫佐剂作用。本研究为研制抗球虫病疫苗提供了理论和物质基础。
【关键词】：堆型艾美耳球虫 Rhomboid 核酸疫苗 抗球虫指数 免疫保护
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 鸡球虫概述11-14
• 1.1.1 鸡球虫及其发育史11-12
• 1.1.2 鸡球虫入侵机制研究进展12-13
• 1.1.3 Rhomboid研究进展13-14
• 1.2 鸡抗球虫免疫反应14-16
• 1.2.1 体液免疫14-15
• 1.2.2 细胞免疫15-16
• 1.3 IFN-γ研究进展16
• 1.3.1 IFN-γ概述16
• 1.3.2 鸡IFN-γ在抗球虫病中的作用16
• 1.4 抗球虫病DNA疫苗的研究进展16-17
• 1.5 研究的目的与意义17-19
• 2 材料与方法19-38
• 2.1 实验材料19-22
• 2.1.1 实验动物及虫种19
• 2.1.2 菌株、载体及细胞19
• 2.1.3 主要试剂19
• 2.1.4 主要仪器与设备19-20
• 2.1.5 主要试剂的配制20-22
• 2.2 实验方法22-38
• 2.2.1 堆型艾美耳球虫Rhomboid基因的克隆与鉴定22-27
• 2.2.2 Rhomboid蛋白的原核表达及鉴定27-29
• 2.2.3 Rhomboid蛋白多克隆抗体的制备及生物学活性检测29-31
• 2.2.4 重组真核表达质粒的构建及体外瞬时转染31
• 2.2.5 重组真核表达质粒的大量提取及纯化31-33
• 2.2.6 试验动物的分组和处理33-34
• 2.2.7 体外淋巴细胞增殖试验34-35
• 2.2.8 ELISA检测外周血中抗Rhomboid蛋白的IgG抗体水平35
• 2.2.9 免疫重组真核表达质粒对球虫感染的保护效果35-37
• 2.2.10 数据处理37-38
• 3 结果38-55
• 3.1 堆型艾美耳球虫Rhomboid基因的克隆与鉴定38-39
• 3.1.1 Rhomboid基因的克隆38
• 3.1.2 重组克隆质粒pMD18-T-Rhomboid构建与鉴定38-39
• 3.2 Rhomboid蛋白的原核表达及鉴定39-45
• 3.2.1 原核表达质粒pGEX-Rhomboid的构建及鉴定39-40
• 3.2.2 Rhomboid蛋白的原核表达及纯化40-41
• 3.2.3 Rhomboid蛋白多克隆抗体的制备及生物学活性检测41-42
• 3.2.4 重组真核表达质粒的构建及鉴定42-44
• 3.2.5 重组真核表达质粒的体外瞬时表达44-45
• 3.3 雏鸡脾脏及外周血T淋巴细胞增殖功能变化45-48
• 3.3.1 脾脏T淋巴细胞增殖功能变化45-47
• 3.3.2 外周血T淋巴细胞增殖功能变化47-48
• 3.4 雏鸡脾脏及外周血B淋巴细胞增殖功能变化48-50
• 3.4.1 脾脏B淋巴细胞增殖功能变化48-49
• 3.4.2 外周血B淋巴细胞增殖功能变化49-50
• 3.5 Rhomboid蛋白刺激雏鸡脾脏和外周血淋巴细胞增殖功能变化50-52
• 3.5.1 Rhomboid蛋白刺激脾脏淋巴细胞增殖功能变化50-51
• 3.5.2 Rhomboid蛋白刺激外周血淋巴细胞增殖功能变化51-52
• 3.6 外周血中抗Rhomboid蛋白IgG抗体含量动态变化52-53
• 3.7 重组真核表达质粒抗球虫保护效果53-55
• 3.7.1 雏鸡体增重情况53-54
• 3.7.2 克粪便卵囊排出数与十二指肠病变计分54
• 3.7.3 抗球虫指数54-55
• 4 讨论55-59
• 4.1 堆型艾美耳球虫Rhomboid抗原的选择55-56
• 4.2 重组Rhomboid蛋白的表达56
• 4.3 重组DNA疫苗诱导的免疫反应与保护作用56-59
• 4.3.1 雏鸡免疫后T、B淋巴细胞增殖功能变化57
• 4.3.2 Rhomboid蛋白刺激后淋巴细胞增殖功能变化57
• 4.3.3 外周血中抗Rhomboid蛋白IgG抗体动态变化57-58
• 4.3.4 重组DNA疫苗的抗球虫免疫保护效果58-59
• 5 结论59-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-65
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文65

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本文编号：693329