巴贝斯虫中两种硫氧还蛋白（TrX）的克隆和功能鉴定

发布时间：2017-08-18 14:26

  本文关键词：巴贝斯虫中两种硫氧还蛋白（TrX）的克隆和功能鉴定

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【摘要】：田鼠巴贝斯虫属于顶复门原虫,是一种胞内寄生虫,其缺乏过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶,主要通过硫氧还蛋白系统来抵抗宿主免疫细胞产生的活性氧族分子(reactive oxygen species,ROS)和活性氮族分子(reactive nitrogen species,RNS。目前巴贝斯虫的Trx的功能尚不清楚,本研究从巴贝斯虫转录组中筛选出两种硫氧还蛋白分子,Trx5和Trx6,克隆得到其全长基因。本实验通过快速扩增方法分别得到基因Trx5和Trx6的全长序列。Trx5全长770bp,含有一个编码201个aa的开放阅读框,蛋白大小约23KD,无信号肽,具有一个典型的Trx结构域。Trx6全长660bp,含有一个编码142aa的开放阅读框,蛋白大小约17KD,没有信号肽,具有一个硫氧还蛋白样结构域和一个有丝分裂DIM1结构域。Western Blotting和IFAT研究表明,BmTrx5和BmTrx天然蛋白均存在于虫体中。通过胰岛素还原法检测Trx5和Trx6的活性,其原理为:Trx在TrxR、NADPH的作用下可以从氧化型转变为还原型,还原型Trx(Trx-(SH)2)含有巯基,作用胰岛素,自身又变为氧化型,氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫键,在TrxR、NADPH的作用下变成还原型,这个过程需要消耗NADPH,使NADPH转变成NADP+,还原型Trx继续与胰岛素作用,重复此过程。随着NADPH的消耗,反应体系在340nm处的吸光值(OD值)会降低,两个分子的His重组蛋白均表现出氧化还原活性。此研究为抗巴贝斯虫药物和疫苗的开发提供了信息和理论基础。
【关键词】：田鼠巴贝斯虫 硫氧还蛋白 硫氧还蛋白系统 结构 功能
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 中文摘要8-9
• Abstract9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 原虫Trx的结构10-11
• 1.2 Trx的生物学活性11-14
• 1.2.1 抗氧化作用11-12
• 1.2.2 抑制凋亡的作用12
• 1.2.3 蛋白结合作用12-13
• 1.2.4 还原并修复蛋白损伤13
• 1.2.5 生长调节作用13-14
• 1.3 Trx与癌症14-15
• 1.4 小结15-17
• 2 材料与方法17-43
• 2.1 实验材料17
• 2.2 主要仪器17-18
• 2.3 实验试剂18-24
• 2.3.1 主要试剂18
• 2.3.2 试剂配方18-24
• 2.4 B.mTrx5 和Trx6的基因克隆24-28
• 2.4.1 收集田鼠巴贝斯虫虫体24-25
• 2.4.2 田鼠巴贝斯虫总RNA的提取25
• 2.4.3 田鼠巴贝斯虫cDNA的合成25-26
• 2.4.4 田鼠巴贝斯虫Trx5和Trx6保守片段的扩增26-28
• 2.5 表达质粒的构建28-31
• 2.5.1 pET-30a空质粒的提取28-29
• 2.5.2 pET-30a空质粒的双酶切29
• 2.5.3 连接及转化29-30
• 2.5.4 连接产物的转化30
• 2.5.5 阳性菌株鉴定及测序30-31
• 2.6 巴贝斯虫Trx5和Trx6的 3’端快速扩增31-34
• 2.6.1 引物设计31
• 2.6.2 cDNA第一条链的合成31-32
• 2.6.3 3’端的快速扩增32-33
• 2.6.4 PCR扩增产物的链接与转化33
• 2.6.5 3’端快速扩增片段的克隆测序33-34
• 2.7 巴贝斯虫Trx5和Trx65’端快速扩增34-37
• 2.7.1 引物设计34
• 2.7.2 cDNA第一条链的合成34-35
• 2.7.3 cDNA第一链的纯化35
• 2.7.4 cDNA末端加尾35-36
• 2.7.5 目的基因 5’端的快速扩增36-37
• 2.7.6 5’端扩增片段的克隆测序37
• 2.8 全长基因的序列分析37
• 2.9 重组蛋白的表达37-39
• 2.9.1 IPTG诱导蛋白表达37-38
• 2.9.2 SDS-PAGE鉴定重组蛋白38-39
• 2.10 蛋白纯化及定量39-40
• 2.10.1 蛋白纯化39-40
• 2.10.2 蛋白定量40
• 2.11 重组蛋白Trx5和Trx6的活性分析40-41
• 2.12 多克隆抗体的制备41
• 2.13 重组蛋白Trx5和Trx6多克隆抗体的Western blot鉴定41-42
• 2.14 间接免疫荧光实验（IFAT）42-43
• 3 实验结果及分析43-59
• 3.1 总RNA的提取43
• 3.2 保守片段的扩增43-45
• 3.2.1 Trx5的保守片段的扩增43-44
• 3.2.2 Trx6的保守片段的扩增44-45
• 3.3 3’race扩增结果45-47
• 3.3.1 Trx5的 3’端快速扩增45-46
• 3.3.2 Trx6的 3’端快速扩增46-47
• 3.4 5’race扩增结果47-49
• 3.4.1 Trx5的 5’端快速扩增47-48
• 3.4.2 Trx6的 5’端快速扩增48-49
• 3.5 基因的全长及序列分析49-53
• 3.5.1 Trx5基因的全长序列及预测的氨基酸序列49-51
• 3.5.2 Trx6基因的全长序列及预测的氨基酸序列51-53
• 3.6 表达质粒的构建53
• 3.6.1 载体p ET-30a的双酶切53
• 3.6.2 重组质粒的PCR鉴定53
• 3.7 重组蛋白的表达53-54
• 3.8 蛋白纯化与定量54-55
• 3.8.1 蛋白纯化54-55
• 3.8.2 蛋白定量55
• 3.9 重组蛋白的活性分析55-56
• 3.10 重组蛋白Trx5和Trx6的多克隆血清的Western blot鉴定56-57
• 3.11 间接免疫荧光实验（IFAT）检测57-59
• 4 讨论59-61
• 5 结论61-62
• 参考文献62-66
• 致谢66

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本文编号：695071