猪瘟病毒强弱毒株NS5A蛋白对病毒复制效率影响的差异分析

发布时间：2017-08-19 09:24

  本文关键词：猪瘟病毒强弱毒株NS5A蛋白对病毒复制效率影响的差异分析

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【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种接触性、急性烈性传染病。猪瘟对我国的养猪业造成巨大的经济损失,所以它已被我国列为要消灭的重大动物疫病之一。国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)也将其列为优先防治的一类动物疫病。目前,对于猪瘟的预防和控制,主要依靠疫苗接种和捕杀。猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)是预防猪瘟的最有效的疫苗。该疫苗株引起家兔产生定型热反应,并且能在家兔的脾脏和淋巴结内复制。CSFV NS5A蛋白作为该病毒RNA复制酶复合物的成分之一,主要参与病毒基因组的复制。除此之外,NS5A蛋白还能够通过与宿主相互作用等方式,调节病毒基因组复制。本实验室在探究CSFV NS5A蛋白与宿主的翻译延伸因子1A(translation elongation factor 1A,eEF1A)相互作用的过程中,经Western blotting检测,我们发现猪瘟病毒强弱毒株分子量存在差异。由于众多研究表明,NS5A蛋白主要参与病毒基因组的复制。那么,强弱毒株中NS5A蛋白分子量的不同是否对CSFV的强弱毒株产生不同的复制效率呢?为此,我们对NS5A蛋白在CSFV强弱毒株中的复制作用展开了深入的研究。首先,我们构建了表达海肾荧光素酶基因的嵌合报告病毒(r SM-Rluc-HCLVNS5A)以便于我们可以快速、高通量的对病毒复制情况进行定量。通过对报告病毒表达的荧光素酶进行活性分析,我们确定了NS5A蛋白对猪瘟病毒复制水平产生的影响。随后,我们构建了强弱毒株NS5A蛋白互换的嵌合病毒,通过对病毒滴度的测定和荧光定量PCR比较NS5A在强弱毒株上引起复制水平的差异。我们发现,与原有的报告病毒(r SM-Rluc)相比,嵌合报告病毒的Rluc活性下降;以强毒株为骨架,将弱毒株NS5A替换到强毒株后,嵌合病毒(r SM-HCLVNS5A)的基因拷贝数下降,病毒滴度下降大约30倍;以弱毒株为骨架,将强毒株NS5A替换后,嵌合病毒(r HCLV-SMNS5A)基因拷贝数提高,病毒滴度上升约5倍。最后我们在家兔体内了评价了r SM-HCLVNS5A和r HCLV-SMNS5A的定型热反应、复制和免疫原性,发现r HCLV-SMNS5A保持了HCLV株适应家兔的特性,没有影响HCLV株在家兔体内的复制效率,而r SM-HCLVNS5A与石门株相同,并没有引起家兔产生定型热反应,也不在家兔脾脏内复制。总之,本研究首次发现猪瘟病毒强弱毒株的NS5A的蛋白分子量是不同的,并且进一步证实NS5A能够引起猪瘟病毒强弱毒株的复制差异;体内实验发现NS5A的替换并没有改变HCLV株适应家兔的特性,同时也没有影响HCLV株在家兔体内的复制水平。本研究为探究强弱毒株之间的复制效率差异提供思路。
【关键词】：猪瘟病毒 NS5A蛋白 强弱毒株 复制差异
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 猪瘟及猪瘟病毒11-12
• 1.1.1 猪瘟11
• 1.1.2 猪瘟病毒11-12
• 1.2 非编码区、结构蛋白和非结构蛋白的研究进展12-17
• 1.2.1 非编码区的研究进展12
• 1.2.2 结构蛋白的研究进展12-14
• 1.2.3 非结构蛋白的研究进展14-17
• 1.3 猪瘟病毒反向遗传学的研究进展17
• 1.4 研究的目的和意义17-19
• 第二章 猪瘟病毒强弱毒株NS5A蛋白对病毒复制效率的影响19-36
• 2.1 材料和方法19-25
• 2.1.1 病毒、细胞、菌种和质粒19
• 2.1.2 主要仪器设备、抗体和试剂19
• 2.1.3 基因扩增与克隆19-20
• 2.1.4 全长感染性克隆的构建20-22
• 2.1.5 嵌合病毒的拯救22
• 2.1.6 嵌合病毒抗原捕获ELISA的检测22-23
• 2.1.7 嵌合病毒的RT-PCR检测和测序验证23
• 2.1.8 间接免疫荧光试验（IFA）23
• 2.1.9 病毒滴定23-24
• 2.1.10 嵌合病毒荧光定量PCR24
• 2.1.11 嵌合病毒生长曲线的测定24
• 2.1.12 海肾荧光素酶分析24
• 2.1.13 家兔接种试验24-25
• 2.1.14 蛋白质印迹（Western blotting）25
• 2.1.15 统计学分析25
• 2.2 结果25-33
• 2.2.1 强弱毒株NS5A蛋白分子量不同25-26
• 2.2.2 全长感染性克隆的酶切鉴定结果26-27
• 2.2.3 嵌合病毒的鉴定结果27-29
• 2.2.4 弱毒株NS5A蛋白降低CSFV强毒株的复制效率29-31
• 2.2.5 强毒株NS5A蛋白增强CSFV弱毒株的复制效率31-32
• 2.2.6 NS5A不影响HCLV株适应家兔的特性32-33
• 2.3 讨论33-36
• 第三章 全文结论36-37
• 参考文献37-47
• 致谢47-48
• 作者简历48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 HUANG Jun-hua;LI Yong-feng;HE Fan;LI Dan;SUN Yuan;HAN Wen;QIU Hua-ji;;Rapid Recovery of Classical Swine Fever Virus Directly from Cloned cDNA[J];Journal of Integrative Agriculture;2013年05期

2 邹兴启;赵启祖;范运峰;朱元源;王琴;徐璐;范学政;宁宜宝;;猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救[J];中国农业科学;2011年02期

3 彭伍平;夏照和;侯强;李娜;孙元;童光志;仇华吉;;猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析[J];病毒学报;2007年05期

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本文编号：699926