精氨酸调控酪蛋白表达途径相关miRNAs的筛选与表达分析

发布时间：2017-08-19 12:15

  本文关键词：精氨酸调控酪蛋白表达途径相关miRNAs的筛选与表达分析

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【摘要】：功能性氨基酸——精氨酸(Arg)对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白的合成有一定的促进作用,本课题组前期研究了精氨酸调控乳腺上皮细胞酪蛋白合成途径中的相关因子和其功能基因,在此基础上,本研究将进一步探索精氨酸影响奶牛乳腺酪蛋白表达的miRNA分子机制。研究包括以下四个方面部分。试验一精氨酸途径调控酪蛋白表达miRNA的预测该试验通过PicTar和TargetScan两种可以预测靶定目标基因的网络数据库进行预测筛选,对精氨酸调控酪蛋白合成通径相关功能基因的表达起调控作用的miRNA入手,通过网络数据库预测对精氨酸调控酪蛋白合成通径相关功能基因起调作用的miRNAs。结果显示：通过将两种数据库的预测结果进行比对,筛选出精氨酸调控酪蛋白合成通径中mmu-miR-325、mmu-miR-3062、mmu-miR-471-3等53个候选miRNAs可能对酪蛋白的合成具有调控作用。试验二体外法检测精氨酸途径调控酪蛋白合成的重要miRNAs本试验采用本实验室储备的二代奶牛乳腺上皮细胞,添加精氨酸进行体外培养,根据添加的精氨酸的量分为0倍组、1倍组、2倍组,采用RT-PCR方法检测所筛选出精氨酸调控酪蛋白合成途径相关的候选miRNAs的表达情况。结果显示：所筛选出的候选miRNAs中有9条：mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-101a、mmu-miR-760-3p、 mmu-miR-1954、mmu-miR-712、mmu-miR-574-5p、mmu-miR-468及mmu-miR-875-3p在精氨酸组和对照组间差异显著。提示这9条候选的miRNAs可能对精氨酸调控酪蛋白合成途径中相关功能基因的表达起调控作用进而影响乳腺上皮细胞酪蛋白的合成。试验三精氨酸灌注对奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表达的影响本试验选择6头体重、胎次(4胎)、泌乳期(80±2d)、泌乳量(21.0±1.0 kg)体况(3.0)等基本一致的荷斯坦奶牛作为试验动物,分3组,分别为：对照组、精氨酸组、丙氨酸组,每组2头试验牛,采用3×3复拉丁方试验设计,进行颈静脉灌注。结果显示：灌注精氨酸组牛奶中乳蛋白含量和乳品质均有提高；酪蛋白的合成量有所提高,CSN1S1、CSN1S2的表达量显著提高；另外,体外法检测出的差异miRNAs中mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-760-3p、mmu-miR-1954、mmu-miR-712、 mmu-miR-574-5p都在精氨酸组较高(P0.05)；但miR-468在精氨酸组较低(P0.05)。提示精氨酸可能通过影响酪蛋白合成途径这8条候选miRNAs表达的机制来影响酪蛋白合成通路相关基因的表达而最终调控酪蛋白的合成。试验四颈静脉灌注精氨酸对泌乳中期奶牛氮代谢及免疫性能的影响本试验主要研究颈静脉灌注精氨酸对奶牛养分消化、氮代谢和免疫性能的影响。试验设计同试验三。结果表明,乳蛋白氮产量在3组之间的差异显著(P0.05),以精氨酸组最高,丙氨酸组次之,对照组最低。乳蛋白氮占摄入氮比例也以精氨酸组最高,但组间差异不显著(P0.05)。代谢氮占摄入氮比例为精氨酸组对照组丙氨酸组。精氨酸组显著提高了血清中免疫球蛋白IgG浓度、血浆中总蛋白的浓度及白蛋白与球蛋白比例(P0.05)；而谷丙转氨酶及谷草转氨酶等指标不受灌注的影响；同时,该组血清中IL-1、TNF-a水平也较高(P0.05)。总结而言：颈静脉灌注精氨酸可通提高奶牛对氮的消化与利用来提高其乳蛋白的合成量；同时提高了奶牛血液中总蛋白、免疫球蛋白IgG及细胞因子IL-1等的水平,有利于提高奶牛机体的免疫能力和胎儿被动的免疫力。
【关键词】：精氨酸灌注 奶牛 调控 酪蛋白合成 miRNA
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 符号说明11-13
• 第一章 文献综述13-26
• 1.1 精氨酸营养研究进展13
• 1.2 精氨酸的理化性质13-14
• 1.3 精氨酸的吸收与合成代谢14-16
• 1.3.1 精氨酸的合成14-15
• 1.3.2 精氨酸的分解代谢15-16
• 1.4 精氨酸在动物生产中的应用16-18
• 1.4.1 精氨酸对动物生长性能的影响16-17
• 1.4.2 精氨酸对动物屠宰性能的影响17
• 1.4.3 精氨酸对动物繁殖性能的影响17-18
• 1.4.4 精氨酸对动物机体免疫功能的影响18
• 1.5 奶牛乳蛋白的合成及调控通路18-22
• 1.5.1 乳蛋白的组成18-19
• 1.5.2 乳蛋白的合成19
• 1.5.3 调控乳蛋白合成的信号通路19-22
• 1.6 精氨酸与乳蛋白合成22-23
• 1.7 miRNA对泌乳生理的调控23-25
• 1.7.1 miRNA的发生及作用机制23-24
• 1.7.2 miRNA对泌乳生理的调控24-25
• 1.8 本课题立题依据与意义25-26
• 第二章 精氨酸途径调控酪蛋白表达miRNA的预测26-30
• 2.1 材料与方法26-28
• 2.1.1 数据库预测及结果获取27-28
• 2.2 结果与分析28-29
• 2.3 讨论29
• 2.4 小结29-30
• 第三章 体外法检测精氨酸途径调控酪蛋白合成的重要的miRNAs30-41
• 3.1 材料与方法30-33
• 3.1.1 复苏第2代奶牛乳腺上皮细胞30
• 3.1.2 试验设计与方法30-33
• 3.1.3 统计与分析33
• 3.2 结果与分析33-38
• 3.2.1 酪蛋白基因表达鉴定结果33
• 3.2.2 miRNA的RT-qPCR结果分析33-34
• 3.2.3 稳定表达的miRNA在各处理中表达34-37
• 3.2.4 目标miRNA在各处理中相对表达结果37-38
• 3.3 讨论38-40
• 3.4 小结40-41
• 第四章 精氨酸灌注对奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表达的影响41-61
• 4.1 材料与方法41-48
• 4.1.1 试验动物41-42
• 4.1.2 仪器设备42-43
• 4.1.3 主要试剂和材料43
• 4.1.4 试验方法43-48
• 4.2 结果与分析48-56
• 4.2.1 精氨酸灌注对乳品质动态变化的影响48-50
• 4.2.2 精氨酸灌注对酪蛋白含量动态变化的影响50-52
• 4.2.3 总RNA的纯度与完整性52-53
• 4.2.4 目的基因和内参基因的扩增曲线和熔解曲线53-54
• 4.2.5 精氨酸灌注对酪蛋白基因表达的影响54
• 4.2.6 精氨酸灌注对信号转导相关基因表达的影响54-55
• 4.2.7 精氨酸灌注对酪蛋白合成途径miRNA表达的影响55-56
• 4.3 讨论56-59
• 4.3.1 精氨酸灌注对牛奶蛋白合成的影响56-57
• 4.3.2 精氨酸灌注对牛奶酪蛋白含量的影响57-58
• 4.3.3 精氨酸调控酪蛋白基因表达的miRNA机制58-59
• 4.4 小结59-61
• 第五章 颈静脉灌注精氨酸对泌乳中期奶牛氮代谢及免疫性能的影响61-69
• 5.1 材料与方法61-63
• 5.1.1 试验动物及试验设计61
• 5.1.2 仪器设备61
• 5.1.3 样品的采集61-62
• 5.1.4 试验方法62-63
• 5.1.5 统计分析63
• 5.2 结果与分析63-66
• 5.2.1 养分表观消化率63-64
• 5.2.2 氮平衡64-65
• 5.2.3 对泌乳奶牛血清中免疫球蛋白的影响65-66
• 5.2.4 对泌乳奶牛血液生化指标的影响66
• 5.2.5 对泌乳奶牛血清中IL-1,IL-6及TNF-α水平的影响66
• 5.3 讨论66-68
• 5.3.1 精氨酸灌注对奶牛氮代谢的影响66-68
• 5.3.2 将氨酸灌注对奶牛免疫性能的影响68
• 5.4 小结68-69
• 第六章 全文结论69-71
• 6.1 全文结论69-70
• 6.2 创新点70
• 6.3 进一步要研究的问题70-71
• 参考文献71-83
• 致谢83-84
• 攻读硕士学位期间发表的论文84-85

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