鹅Ⅲ型干扰素及其受体的鉴定、组织表达与免疫学特性研究

发布时间：2017-08-20 06:08

  本文关键词：鹅Ⅲ型干扰素及其受体的鉴定、组织表达与免疫学特性研究

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【摘要】：干扰素(IFNs)是病原微生物入侵,诱导机体产生的一类具有抗病毒活性的细胞因子,属机体Ⅱ类细胞因子,在先天免疫应答中起着非常重要的作用。目前,根据氨基酸序列、结构特点以及受体特性等,将干扰素分为Ⅲ类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素。Ⅲ型干扰素(IFN-λs)为2003年发现的一类新型干扰素,其抗病毒作用并不是直接杀伤病毒,而是通过与其特异受体IFNLR1和IL-10R2构成的异源二聚体复合物结合,激活与Ⅰ型干扰素相似的JAK-STAT信号通路,诱导一系列具有抗病毒作用的干扰素刺激基因(ISGs)。本研究首次克隆获得鹅Ⅲ型干扰素(goIFNL)及其特异受体(goIFNLR1)的cDNA序列,并进行了相关生物信息学分析。goIFNL的cDNA序列获得823 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码189aa; goIFNLR1序列获得1952 bp,包含-个完整的开放阅读框,编码512 aa。通过NJ法进化树分析,显示这两个基因属于鸟类这一分支,与禽类亲缘关系更为接近。应用实时荧光定量PCR方法对goIFNL和goIFNLR1的组织分布情况进行探索,结果显示goIFNL主要分布在呼吸道组织肺脏(LU)、气管(TR);胃肠道组织小肠(SI)、肌胃(GI)；皮肤(SK);胰腺(P)及全血(Blood)等上皮细胞丰盛的组织中,其特异受体goIFNLR1具有相似的组织分布情况。为了解goIFNL的免疫学特性,选用四种TLR的激动剂及三种禽类相关病毒分别刺激鹅外周血单.核细胞建立体外感染细胞模型,结果显示在TLR3的激动剂Poly (I:C)以及TLR9的激动剂ODN2006的刺激下,goIFNL mRNA的转录水平得到显著性的提升。在TLR4的激动剂LPS及TLR7的激动剂R848的刺激下,goIFNL mRNA的转录水平相较对照组无显著性差异。goIFNLR1 mRNA的转录水平在这四种TLR的激动剂的刺激下相较对照组均无显著性差异。紧接着,我们又探究了鹅重要传染病的病毒病原对目标分子的影响：在小鹅瘟(GPV)病毒的感染下,goIFNL mRNA的转录水平具有显著性的升高;在低致病性禽流感病母(H9N2 AIV)及鸭坦布苏病毒(DTMUV)的感染下,goIFNL mRNA的转录水平相较对照组无显著性差异,而goIFNLR1 mRNA的转录水平在这三种病毒的刺激下均无显著性差异。同时,选用这三种禽类病毒人工感染雏鹅建立体内动物模型,经qRT-PCR检测goIFNL及goIFNLR1 mRNA的转录水平,结果显示在H9N2AIV的感染下,goIFNL的表达量相较对照组在肺脏组织(LU)中有近20倍的提升,在胰腺组织(P)中有近40倍的提升。而在其他两种病毒的感染下,goIFNL及goIFNLR1 mRNA的转录水平相较对照组无显著性差异。以上结果表明goIFNL在鹅的抗病毒固有免疫中扮演着一定的角色。为进一步了解其生物学功能,选择对goIFNL进行原核和真核表达,分别构建pET-32a-goIFNL原核表达载体及pcDNA3.1-goIFNL真核表达载体。构建的原核表达质粒以IPTG终浓度0.8mM诱导3h的条件在大肠杆菌BL21 (DE3)中被成功诱导表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。利用Ni-NTA亲和层析纯化重组goIFNL融合蛋白,并以此为免疫原制备鼠抗goIFNL多克隆抗体。经Western-Blot验证,真核表达重组质粒pcDNA3.1-goIFNL能在BHK21细胞中表达goIFNL蛋白,这为goIFNL抗病毒免疫学功能的研究奠定了基础。综上,本研究成功克隆了goIFNL及goIFNLRl基因,并对其在鹅的组织分布及其免疫学特性进行了初步研究,goIFNL的原核表达及真核表达为后续进行生物学活性的研究奠定了基础。
【关键词】：鹅Ⅲ型干扰素(goIFNL) 鹅Ⅲ型干扰素受体(goIFNLR1) 分子克隆 组织表达谱 免疫学特性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S835
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1 干扰素简介11
• 2 干扰素的分类和特点11-17
• 2.1 Ⅲ型干扰素基因结构12
• 2.2 IFN-λs的信号通路12-14
• 2.3 IFN-λs的生物学活性14-17
• 3 禽类Ⅲ型干扰素研究进展17
• 4 本研究的目的及意义17-19
• 第二章 鹅Ⅲ型干扰素及其受体的克隆及组织分布研究19-32
• 1 实验材料19-20
• 1.1 实验动物19
• 1.2 主要试剂19-20
• 1.3 主要仪器和设备20
• 1.4 相关溶液的配制20
• 2 实验方法与操作20-28
• 2.1 总RNA的抽提及纯度检测20-21
• 2.2 第一链cDNA的合成21
• 2.3 goIFNL及goIFNLR1保守片段的扩增和鉴定21-24
• 2.4 goIFNL及goIFNLR1 cDNA末端快速扩增24-25
• 2.5 goIFNL和goIFNLR1 cDNA全长序列的获得25-26
• 2.6 goIFNL和goIFNLR1的组织表达谱构建26-27
• 2.7 数据统计分析27-28
• 3 实验结果28-31
• 3.1 goIFNL和goIFNLRl基因的克隆28
• 3.2 goIFNL的组织表达谱28-29
• 3.3 goIFNLRl的组织表达谱29-31
• 4 讨论31-32
• 第三章 生物信息学相关分析32-43
• 1 实验结果32-41
• 1.1 goIFNL和goIFNLR1开放阅读框序列分析32-36
• 1.2 goIFNL二级结构预测36-37
• 1.3 goIFNL和goIFNLR1开放阅读框的多序列比对分析37-39
• 1.4 goIFNL和goIFNLR1氨基酸序列的进化树分析39-41
• 2 讨论41-43
• 第四章 鹅Ⅲ型干扰素的免疫学特性研究43-52
• 1 实验材料44-45
• 1.1 实验动物及毒株44
• 1.2 主要试剂44
• 1.3 主要仪器和设备44-45
• 2 实验方法与操作45-47
• 2.1 鹅外周血单核细胞的分离45
• 2.2 免疫刺激剂和病毒处理外周血单核细胞45-46
• 2.3 体内感染实验46
• 2.4 免疫应答检测46-47
• 3 实验结果47-50
• 3.1 免疫刺激剂处理鹅外周血单核细胞47-48
• 3.2 病毒刺激鹅外周血单核细胞48-49
• 3.3 病毒体内感染动物模型49-50
• 4 讨论50-52
• 第五章 鹅Ⅲ型干扰素的体外重组表达52-76
• 1 实验材料52-57
• 1.1 实验试剂耗材52-53
• 1.2 主要仪器和设备53
• 1.3 菌种、质粒、细胞和实验动物53
• 1.4 相关溶液的配制53-57
• 2 实验方法57-67
• 2.1 goIFNL的原核表达57-62
• 2.2 goIFNL多克隆抗体制备62-63
• 2.3 goIFNL的真核表达63-67
• 3 实验结果67-74
• 3.1 PCR扩增goIFNL目的片段67-68
• 3.2 表达质粒的构建68-71
• 3.3 优化IPTG诱导表达pET-32a-goIFNL重组质粒71
• 3.4 蛋白诱导表达及纯化71-72
• 3.5 goIFNL的真核表达72-74
• 4 讨论74-76
• 全文小结76-77
• 参考文献77-82
• 致谢82-83
• 作者简介及发表论文情况83

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本文编号：704961