奶牛乳房炎酵母样真菌的分离鉴定与荧光定量PCR检测方法的建立

发布时间：2017-08-20 10:18

  本文关键词：奶牛乳房炎酵母样真菌的分离鉴定与荧光定量PCR检测方法的建立

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【摘要】：奶牛真菌性乳房炎常因误诊耽误正确的治疗而变成顽固性乳房炎。为调查南宁市某牛场奶牛乳房炎酵母样真菌的感染情况以及主要病原真菌种类,本试验采集该牛场乳样198份,经体细胞计数检测,结合奶牛产奶量,临床表现,乳样外观等,检测到临床型乳房炎乳样92份(46.46%),隐性乳房炎乳样17份(8.58%),对这些乳样进行酵母样真菌的分离鉴定,其中有51份乳样中分离到酵母样真菌。经假菌丝及酵母样真菌生化管鉴定,查看TH 15-C酵母样真菌生化鉴定编码册,鉴定结果如下：37份乳样中分离到白色念珠菌(72.54%),6份乳样中分离到砝码念珠菌(11.76%),6份乳样中分离到奥么毕赤酵母菌(11.76%),2份乳样中分离到胶粘红酵母菌(3.94%)。随机选取21株临床分离酵母样真菌菌株,用4种抗真菌药敏纸片和4种抗生素药敏纸片对其进行药敏试验,结果它们均对制霉菌素有较高的敏感性,大部分菌株对两性霉素B、酮康唑中度敏感,几乎全部菌株对氟康唑以及丁胺卡那、头孢曲松、庆大霉素、链霉素耐药。本试验结果为南宁市该牛场乳房炎酵母样真菌感染的治疗提供了用药参考,且为此类乳房炎的综合防治提供了理论基础。奶牛真菌性乳房炎会给奶牛乳房组织造成不同程度的、不可逆转的病理性损伤,甚至导致奶牛被淘汰或死亡。其中白色念珠菌是引起奶牛真菌性乳房炎的最主要致病菌之一。临床上仍然使用传统培养法检测白色念珠菌,该方法耗时较长,可能会延误治疗而导致动物病情加重。故有必要建立一种可以快速准确诊断奶牛乳房炎白色念珠菌的方法。本研究依据白色念珠菌的ITS 2序列设计了一对引物,建立了可以快速诊断白色念珠菌的SYBR Green-I荧光定量PCR方法。本试验所得白色念珠菌荧光定量PCR反应的标准曲线方程为：y=-3.448x+39.72,其线性系数R2=1.00,其扩增效率为95%,可检测白色念珠菌质粒的最低浓度为1.03×101拷贝/uL。通过融解曲线分析确定该反应白色念珠菌的Tm值为87.25℃-88.25℃。使用本试验建立的SYBR Green-I荧光定量PCR反应分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,无乳链球菌等多种乳房炎致病菌进行扩增,均无融解曲线产生,证明该反应的特异性良好。重复性试验结果,五个浓度标准品的批内变异系数分别为0.90%,0.39%,0.34%,0.13%,0.12%,批间变异系数分别为0.21%,0.26%,0.37%,0.13%,0.19%,均在5%以下,证明该反应的重复性良好。对40份临床乳样进行检测,以传统培养法为标准,本试验建立的白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、符合率分别为100%,90.91%,96.77%。以普通PCR方法为标准,本试验建立的SYBR Green-I荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、符合率分别为90.32%,100%,93.02%。以上结果表明,本试验建立的奶牛乳房炎白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。本试验为奶牛乳房炎白色念珠菌的早期快速定量诊断提供了科学依据,但若要将其应用于临床诊断还需进行大量实践研究。
【关键词】：乳房炎 药敏试验 白色念珠菌 荧光定量PCR
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 英文缩略词表15-16
• 第一章 绪论16-33
• 1.1 奶牛酵母样真菌性乳房炎16-20
• 1.1.1 奶牛酵母样真菌性乳房炎概述16-17
• 1.1.2 奶牛酵母样真菌性乳房炎的病因17-18
• 1.1.3 奶牛酵母样真菌性乳房炎的临床特征18
• 1.1.4 奶牛酵母样真菌性乳房炎的流行病学调查18-19
• 1.1.5 奶牛酵母样真菌性乳房炎的诊断19-20
• 1.1.6 奶牛酵母样真菌性乳房炎的防治20
• 1.2 白色念珠菌20-25
• 1.2.1 白色念珠菌的生物学特性20-21
• 1.2.2 白色念珠菌诊断方法概述21-25
• 1.3 实时荧光定量PCR(qPCR)技术25-31
• 1.3.1 荧光定量PCR技术的原理25-26
• 1.3.2 荧光定量PCR技术的分类26-28
• 1.3.3 荧光定量PCR技术的定量方法28-29
• 1.3.4 融解曲线分析29-30
• 1.3.5 荧光定量PCR技术在兽医学中的应用30-31
• 1.4 本研究的目的和意义31-33
• 第二章 南宁市某奶牛场奶牛乳房炎酵母样真菌的分离鉴定及药敏试验33-43
• 2.1 试验材料33-34
• 2.1.1 试验试剂33
• 2.1.2 试验设备33-34
• 2.1.3 主要试剂的配制34
• 2.2 试验方法34-36
• 2.2.1 乳样的来源34
• 2.2.2 乳样的采集34-35
• 2.2.3 乳样的分装35
• 2.2.4 乳样的SCC检测35
• 2.2.5 乳样酵母样真菌的分离35
• 2.2.6 乳样酵母样真菌的鉴定35
• 2.2.7 菌种的保存35-36
• 2.2.8 临床分离酵母样真菌菌株的药敏试验36
• 2.2.9 数据统计分析36
• 2.3 结果36-40
• 2.3.1 乳样SCC检测结果36-37
• 2.3.2 乳样中酵母样真菌分离结果37-38
• 2.3.3 乳样中酵母样真菌鉴定结果38-40
• 2.3.4 临床分离酵母样真菌菌株药敏试验结果40
• 2.4 讨论40-43
• 第三章 奶牛乳房炎白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR技术检测方法的建立与应用43-64
• 3.1 材料43-46
• 3.1.1 试验菌株43
• 3.1.2 试验试剂43-44
• 3.1.3 试验设备44
• 3.1.4 试验试剂配方44-46
• 3.2 试验方法46-51
• 3.2.1 白色念珠菌标准菌株的活化46
• 3.2.2 菌株DNA模板的提取46
• 3.2.3 引物的设计46-47
• 3.2.4 普通PCR反应体系的建立47
• 3.2.5 普通PCR产物的鉴定47
• 3.2.6 普通PCR产物胶回收47-48
• 3.2.7 pEasy-T1载体连接和转化48-49
• 3.2.8 质粒的提取49
• 3.2.9 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR反应标准品的制备、标准曲线的制作及融解曲线的建立49-50
• 3.2.10 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法的特异性试验50
• 3.2.11 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法的敏感性试验50
• 3.2.12 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法的重复性试验50-51
• 3.2.13 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法临床样品检测的初步应用51
• 3.2.14 数据统计分析51
• 3.3 结果51-60
• 3.3.1 白色念珠菌PCR反应退火温度优化结果51-52
• 3.3.2 PCR扩增产物的验证52-53
• 3.3.3 重组质粒PCR鉴定结果53-54
• 3.3.4 白色念珠菌部分核酸序列重组质粒测序结果54
• 3.3.5 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR反应的标准曲线54-55
• 3.3.6 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR反应的融解曲线55-56
• 3.3.7 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法的特异性试验结果56
• 3.3.8 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法的敏感性试验结果56-58
• 3.3.9 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法的重复性试验结果58-59
• 3.3.10 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR方法的临床样本检测试验结果59-60
• 3.4 讨论60-64
• 3.4.1 建立SYBR Green-I荧光定量PCR方法检测乳房炎白色念珠菌的重要性60
• 3.4.2 白色念珠菌目的基因的选择60-61
• 3.4.3 白色念珠菌DNA的提取61
• 3.4.4 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR反应的融解曲线分析61-62
• 3.4.5 白色念珠菌SYBR Green-I荧光定量PCR方法的灵敏性、特异性、重复性及临床检测结果分析62-63
• 3.4.6 荧光定量PCR技术诊断白色念珠菌63-64
• 全文结论64-65
• 参考文献65-72
• 攻读学位期间发表的学术论文72-73
• 致谢73

【参考文献】

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本文编号：706055