猪细小病毒基因组序列分析与灭活疫苗的制备及免疫效果评价

发布时间：2017-08-21 19:40

  本文关键词：猪细小病毒基因组序列分析与灭活疫苗的制备及免疫效果评价

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【摘要】：猪细小病毒病(Porcine parvovirus infection,PPI)又称猪的繁殖障碍病,是由猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一种猪的繁殖障碍病。猪是唯一的易感动物。PPV主要感染妊娠前期的母猪,引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、木乃伊化、弱胎及不孕等危害,给养猪业造成了重大损失。因此,控制PPI对养猪业具有十分重要的意义。本研究对经PCR进行扩增的PPV核酸阳性的病料进行处理后,在猪睾丸(Swine testicular cells,ST)细胞上进行病毒分离,获得1株PPV,命名为PPVGD。对获得的PPVGD分离株进行了病毒的耐脂溶剂、耐酸、耐热及耐胰酶的理化特性鉴定,这些特性与PPV相符。根据GenBank上已公布的PPV序列,设计合成引物,对PPVGD分离株基因组进行PCR扩增并进行序列测定,获得包含全部编码区4251 bp的基因组序列。将PPVGD分离株与GenBank公布的44株PPV参考毒株NS1基因和55株PPV参考毒株的VP2基因的核苷酸序列、氨基酸序列分别进行比对分析,并绘制进化树。核苷酸序列相似性分析表明:PPVGD分离株的NS1基因的核苷酸序列与中国分离株HN-G、HN-H、HN-K的相似性最高,为99.9%,与33760005-3a株的相似性最低,为98.2%。PPVGD分离株的VP2基因的核苷酸序列与美国经典株NADL-2和POVNADL-2的相似性最高,为99.7%,与15425株最低,为98.1%。氨基酸序列相似性分析表明,PPVGD分离株的NS1基因的氨基酸序列与中国分离株HN-G、HN-K、J-PPV和NJ及美国毒株NADL-2、POVNADL-2和Kresse的相似性最高,为99.7%;与33760005-3a株的相似性最低,为98.0%。PPVGD分离株的VP2基因的氨基酸序列与中国分离株HN-I和美国毒株NADL-2和POVNADL-2的相似性最高,为99.0%;与WB-773和21620005-1h株的相似性最低,为96.4%。本研究将PPVGD分离株在ST细胞上增殖,并对病毒增殖条件进行了优化,获得了大量的病毒液,为疫苗的制备奠定了基础。培养的PPVGD病毒液的血凝效价可达1:29。利用获得的病毒液,按照中国生物制品规程制备了PPV分离株的油乳剂灭活疫苗。制备的PPVGD灭活疫苗分别免疫350 g左右健康豚鼠和4月龄左右的后备母猪。豚鼠免疫28 d后采血、后备母猪免疫14 d后、28 d后分别采血。后备母猪28 d时加强免疫一次,加强免疫14 d后再采血,对免疫动物的血清分别进行血凝抗体效价的测定。结果表明,豚鼠和后备母猪免疫28 d后的HI抗体效价均达1:26以上,表明该疫苗具有良好的免疫原性。并且免疫PPVGD灭活疫苗后,均无不良反应,表明疫苗的安全性好,为疫苗的进一步研制奠定了基础。
【关键词】：猪细小病毒 序列分析 灭活疫苗 免疫
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 本论文常用缩写词7-12
• 1 前言12-23
• 1.1 猪细小病毒的概述12
• 1.2 猪细小病毒流行病学12-13
• 1.3 PPV的分子生物学特点13-15
• 1.3.1 基因组结构与主要编码蛋白13-14
• 1.3.2 PPV复制和转录特点14-15
• 1.4 PPV病原学15-16
• 1.4.1 PPV的理化特性15
• 1.4.2 PPV的血凝性15
• 1.4.3 PPV的致病性及临床表现型15-16
• 1.5 PPV的诊断方法16-18
• 1.5.1 PPV的分离培养16
• 1.5.2 血清学方法16-18
• 1.6 分子生物学方法18-19
• 1.6.1 PCR检测技术18-19
• 1.6.2 核酸探针技术19
• 1.7 PPV疫苗概况19-22
• 1.7.1 PPV灭活疫苗19-20
• 1.7.2 PPV弱毒疫苗20-21
• 1.7.3 其他新型疫苗21-22
• 1.8 本论文研究的目的与意义22-23
• 2 材料与方法23-41
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 菌株、毒株和细胞23
• 2.1.2 主要酶类及其它相关试剂23
• 2.1.3 常用溶液的配制23-24
• 2.1.4 细菌培养基配制24-25
• 2.1.5 主要仪器及设备25
• 2.1.6 实验动物25
• 2.2 方法25-41
• 2.2.1 PPV的分离与鉴定25-28
• 2.2.2 PPVGD分离株基因组的扩增28-33
• 2.2.3 各基因序列的拼接及分析33-35
• 2.2.4 PPVGD分离株的培养35-38
• 2.2.5 病毒无菌检验38
• 2.2.6 PPVGD分离株的灭活38
• 2.2.7 PPVGD灭活效果的检测38
• 2.2.8 PPVGD分离株灭活疫苗的制备38-39
• 2.2.9 PPVGD灭活疫苗的质量检测39
• 2.2.10 PPVGD灭活疫苗免疫效果的评价39-41
• 3 结果与分析41-54
• 3.1 PPV的分离与鉴定41
• 3.2 PPV分离培养及理化鉴定41-42
• 3.2.1 PPVGD分离株细胞病变观察41-42
• 3.2.2 PPVGD 分离株血凝效价的测定42
• 3.3 PPVGD分离株的理化学性质鉴定42
• 3.4 PPVGD分离株基因组各片段克隆42-49
• 3.4.1 基因扩增42-43
• 3.4.2 重组质粒的PCR鉴定43
• 3.4.3 PPV分离株各基因测序结果及序列拼接43-44
• 3.4.4 PPVGD分离株和参考毒株的NS1核苷酸和氨基酸同源性比较44-46
• 3.4.5 PPVGD分离株和参考毒株的VP2核苷酸和氨基酸同源性比较46-49
• 3.4.6 PPVGD株遗传进化关系分析49
• 3.5 PPVGD分离株培养条件优化49-51
• 3.5.1 细胞培养液NCS浓度的确定49-50
• 3.5.2 维持液NCS浓度的确定50
• 3.5.3 接毒时细胞密度的确定50
• 3.5.4 细胞接毒剂量的确定50-51
• 3.5.5 收毒时间确定51
• 3.6 PPVGD灭活疫苗的制备51-52
• 3.6.1 PPVGD分离株血凝效价的测定51
• 3.6.2 PPVGD灭活效果的检测51
• 3.6.3 PPVGD灭活疫苗质量的检测51-52
• 3.7 PPVGD灭活疫苗免疫效果的评价52-54
• 3.7.1 豚鼠-动物模型52-53
• 3.7.2 猪-动物模型53-54
• 4 讨论54-59
• 4.1 PPV分离株基因组序列分析54-55
• 4.2 PPVGD分离株的增殖培养55-56
• 4.3 PPV滴度测定56-57
• 4.4 PPVGD灭活疫苗的制备57-58
• 4.5 抗体检测58-59
• 全文总结59-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-65
• 附录65-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：714764