鸭疫里氏杆菌sprT基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

发布时间：2017-08-22 11:10

  本文关键词：鸭疫里氏杆菌sprT基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

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【摘要】：鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种细菌性传染病。血清型众多、交叉保护力低、易产生耐药性使该病难以防控。因此,加强对鸭疫里氏杆菌致病机制的研究对防制该病具有重要意义。Por分泌系统(Por secretion system,Por SS),也称为Ⅸ型分泌系统(T9SS)。广泛分布于拟杆菌门成员中,介导拟杆菌门细菌的运动性及致病机制。生物信息学分析发现RA-YM株基因组存在完整的Por SS系统编码基因。sprT基因是Por SS系统关键组件。因此,本研究构建了RA-YM株sprT基因(RAYM_03924)缺失株,对缺失株生物学特性开展了研究,具体研究内容如下:1、鸭疫里氏杆菌RA-YM株sprT基因缺失株的构建与鉴定以RA-YM株基因组为模板,扩增sprT基因上、下游同源臂,利用重叠PCR方法将上、下游同源臂与壮观霉素基因融合,构建壮观霉素抗性基因表达盒,经双酶切后与p RE-112连接,构建自杀性质粒p RE-LSR。将构建成功的自杀性质粒p RE-LSR转化E.coli X7213,以含有p RE-LSR的E.coli X7213为供体菌,以RA-YM株为受体菌,采取双亲本接合转移的方法筛选sprT基因缺失株。挑取在含有壮观霉素的TSA平板上生长的单菌落,利用双重PCR鉴定sprT基因缺失突变株,成功构建了RA-YM株sprT基因缺失株ΔsprT。2、鸭疫里氏杆菌RA-YM株sprT基因缺失株生物学特性研究比较了突变株ΔsprT与亲本株RA-YM的生长特性和生化特性,结果显示ΔsprT在对数早期的生长速度快于RA-YM,ΔsprT和RA-YM主要生化特性一致,但ΔsprT不能液化明胶。突变株ΔsprT和RA-YM对高盐耐受浓度一致,均为1.88%。ΔsprT对胆盐的耐受浓度为23.4μg/m L,RA-YM对胆盐的耐受浓度为46.9μg/m L。血清抗性试验结果显示,突变株ΔsprT在12.5%正常鸭阴性血请的存活率显著高于RA-YM。对突变株ΔsprT和亲本株胞外分泌蛋白的明胶酶谱分析发现,ΔsprT不能够分泌明胶酶,表明sprT基因缺失导致某些蛋白分泌障碍。3、鸭疫里氏杆菌RA-YM株sprT基因缺失株对雏鸭致病性的研究比较了ΔsprT与RA-YM对10日龄雏鸭的毒力,经腿部肌肉注射感染,RA-YM株LD50为3.82×104CFU,ΔsprT株LD50为1.61×109CFU,毒力较亲本株下降约4.21×104倍;雏鸭感染试验结果显示,在感染后24h,ΔsprT在血液、肝脏、和脾脏的组织载菌量显著低于RA-YM;在感染后48h,ΔsprT在心脏、肝脏、脾脏和脑的组织载菌量显著低于RA-YM,表明ΔsprT对组织的侵袭力比亲本株下降;病理切片观察发现,ΔsprT对心脏,肝脏、脾脏和脑组织的病变程度显著比亲本株轻微,表明ΔsprT的致病性较RA-YM显著下降。本研究发现sprT基因缺失突变后致其毒力显著下降,表明通过Por SS系统分泌的因子是鸭疫里氏杆菌重要的毒力因子,值得进一步深入研究。
【关键词】：鸭疫里氏杆菌 PorSS sprT 致病性 生物学特性
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 缩略词表10-11
• 1 文献综述11-20
• 1.1 鸭疫里氏杆菌病的发展与现状11-13
• 1.1.1 形态及染色11
• 1.1.2 培养及生化特性11
• 1.1.3 血清型11-12
• 1.1.4 流行病学12
• 1.1.5 临床病症12
• 1.1.6 病理剖检12
• 1.1.7 诊断12
• 1.1.8 防控与治疗12-13
• 1.2 鸭疫里氏杆菌毒力相关因子13-14
• 1.2.1 质粒13
• 1.2.2 明胶水解酶13
• 1.2.3 酰基合成酶13-14
• 1.2.4 TonB依赖受体TbdR114
• 1.2.5 二肽肽酶Ⅳ14
• 1.2.6 糖基转移酶14
• 1.2.7 脂蛋白14
• 1.3 革兰氏阴性菌的分泌系统14-20
• 1.3.1 牙龈卟啉单胞菌PorSS系统16
• 1.3.2 哈氏噬纤维菌PorSS系统16
• 1.3.3 约氏黄杆菌PorSS系统16-18
• 1.3.4 黄褐二氧化碳嗜纤维菌PorSS系统18-19
• 1.3.5 鸭疫里氏杆菌PorSS系统19-20
• 2 目的和意义20-21
• 3 材料与方法21-30
• 3.1 实验材料21-24
• 3.1.1 菌株、质粒以及细菌的培养条件21
• 3.1.2 工具酶及主要试剂21-22
• 3.1.3 试验动物22
• 3.1.4 培养基、抗生素及其它溶液的配制22-23
• 3.1.5 主要仪器设备23
• 3.1.6 引物23-24
• 3.2 实验方法24-30
• 3.2.1 壮观霉素抗性基因与sprT基因上下游同源臂的克隆24
• 3.2.2 壮观霉素抗性表达盒的构建与鉴定24-27
• 3.2.3 自杀性质粒pRE-LSR的构建与鉴定27
• 3.2.4 sprT基因缺失突变株的构建及鉴定27
• 3.2.5 sprT基因缺失突变株生物学特性的研究27-29
• 3.2.6 sprT基因缺失突变株致病性的研究29-30
• 4 结果与分析30-39
• 4.1 壮观霉素抗性基因与sprT基因上下游同源臂的扩增30
• 4.2 壮观霉素抗性基因表达盒的构建与鉴定30
• 4.3 自杀性质粒pRE-LSR的构建及鉴定30-31
• 4.4 sprT基因缺失突变株的构建及鉴定31-32
• 4.5 sprT基因缺失突变株生物学特性的研究32-34
• 4.5.1 sprT基因缺失突变株遗传稳定性32
• 4.5.2 sprT基因缺失突变株生化特性鉴定结果32-33
• 4.5.3 sprT基因缺失突变株生长曲线的测定33
• 4.5.4 sprT基因缺失突变株抗补体能力的测定33-34
• 4.5.5 sprT基因缺失突变株在高盐状态的生长特性34
• 4.5.6 sprT基因缺失突变株胆盐耐受能力的测定34
• 4.5.7 sprT基因缺失突变株明胶酶谱试验34
• 4.6 鸭疫里氏杆菌sprT基因缺失突变株致病性的研究34-39
• 4.6.1 鸭疫里氏杆菌sprT基因缺失突变株LD50的测定34-35
• 4.6.2 sprT基因缺失突变株组织载菌量的测定35-36
• 4.6.3 sprT基因缺失突变株病理组织学观察36-39
• 5 讨论39-41
• 5.1 鸭疫里氏杆菌sprT基因缺失突变株生物学特性的研究39
• 5.2 鸭疫里氏杆菌毒力的研究39-40
• 5.3 对sprT基因缺失突变株后续工作的展望40-41
• 6 结论41-42
• 参考文献42-46
• 致谢46

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本文编号：718785