一步反转录FRET-qPCR检测甲型流感病毒方法的建立及应用

发布时间：2017-08-23 07:13

  本文关键词：一步反转录FRET-qPCR检测甲型流感病毒方法的建立及应用

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【摘要】：流感病毒基于其核蛋白抗原的多样性,分为甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型,其中甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)具有广泛的宿主谱；抗原漂移和抗原转换导致新IAV血清亚型和变异株不断出现,甚至产生高致病性强毒株,并且可能跨越物种障碍进而感染人类,造成局部地区乃至世界范围流感疫情的暴发。因此,IAV不同血清亚型和变异株的快速检测对甲型流感的防控具有重要意义。目前IAV检测方法主要有病原学、血清学和分子生物学诊断技术。其中病原学方法耗时费力；血清学方法特异性较低,容易出现交叉反应；分子生物学诊断技术敏感性和特异性较强,但多为两步法,且不能同时检测多个IAV血清亚型。因此,本研究主要是建立一种快速灵敏,可检测所有常见IAV血清亚型的方法,并且成功地应用于我国活禽市场家禽的IAV检测。一步反转录FRET-qPCR检测甲型流感病毒方法的建立本研究主要是基于68个IAV血清亚型的基质蛋白(M)基因,设计特异性引物和探针,建立一种一步反转录FRET-qPCR检测IAV的方法(PCR产物169 bp)。将特异性引物和探针进行BLAST检索,证实与IAV血清亚型高度匹配的有122个,包含28,206个IAV序列。应用该方法对H1N1血清亚型病毒株制备的标准品进行检测,表明其灵敏度达到10拷贝／反应;对9株IAV血清亚型病毒株(H1N1、H3N3、H4N6、H5N1、H6N1、H7N9、 H9N2、H10N8、H11N2)的敏感性检测,表明该方法优于传统的鸡胚半数感染量(EID50)测定方法。此外,本试验采集SPF鸡的咽喉和泄殖腔拭子,加入不同稀释度的H9N2,分别用于一步反转录FRET-qPCR方法和EID50试验；并建立基于IAV聚合酶蛋白(PA)基因的反转录PCR方法(575 bp),对一步反转录FRET-qPCR检测的阳性样品进行验证。本研究建立的方法快速灵敏,可同时检测出所有常见IAV血清亚型,为甲型流感疫情的监测和防控提供重要技术支撑。一步反转录FRET-qPCR检测甲型流感病毒方法的应用从我国24省的活禽市场采集1,839只家禽(鸡1,521只、鸭127只、鹅100只、鸽子91只)的咽喉和泄殖腔拭子样品,应用本研究建立的一步反转录FRET-qPCR方法进行IAV检测。结果表明,家禽IAV的阳性率为9.2%(169/1,839),其中鸡的IAV阳性率最高(10.4%;158/1,521),其次是鸭(5.5%；7/127),鸽子(4.4%;4/91),鹅(0%；0/100)；咽喉拭子的IAV阳性率(7.5%；138/1,839)显著高于泄殖腔拭子的IAV阳性率(5.2%；95/1,839;P104),同时咽喉拭子含有的IAV拷贝数也明显高于泄殖腔拭子(106.07vs.105.54；P10-4);咽喉和泄殖腔拭子均为阳性的家禽占总阳性家禽的27.8%(47/169),仅咽喉拭子为阳性的家禽占47.9%(81/169),仅泄殖腔拭子为阳性的家禽占24.3%(41/169)。应用基于PA、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的PCR方法,进一步对反转录FRET-qPC R检测的阳性样品进行IAV血清亚型判定。结果表明,在IAV阳性家禽样品中,H9N2血清亚型占56.8%(96/169),H7N9血清亚型占41.4%(70/169), H5N1血清亚型占1.8%(3/169)。H9N2血清亚型的家禽包括鸡(95.8%；92/96)和鸭(4.2%；4/96),在96个H9N2血清亚型的家禽中,咽喉和泄殖腔拭子均为H9N2血清亚型的家禽占9.3%(9/96),仅咽喉拭子为H9N2血清亚型的家禽占71.9%(69/96),仅泄殖腔拭子为H9N2血清亚型的家禽占18.8%(18/96)；H7N9血清亚型的家禽包括鸡(94.3%；66/70)和鸽子(5.7%;4/70),在70个H7N9血清亚型的家禽中,咽喉和泄殖腔拭子均为H7N9血清亚型的家禽占51.4%(36/70),仅咽喉拭子为H7N9血清亚型的家禽占15.7%(11/70),仅泄殖腔拭子为H7N9血清亚型的家禽占32.9%(23/70)；H5N1血清亚型仅在鸭中检出(n=3),其中2只的咽喉和泄殖腔拭子均为H5N1血清亚型,1只仅咽喉拭子为H5N1血清亚型。综上所述,本研究建立了基于M基因检测IAV血清亚型的一步反转录FRET-qPCR方法,并通过基于PA、HA和NA基因的反转录PCR方法进行验证。应用该方法对我国24省的活禽市场中家禽咽喉和泄殖腔拭子进行检测分型的结果表明,家禽IAV的阳性率为9.2%(169/1,839),其中鸡的IAV阳性率最高(10.4%；158/1,521)；咽喉拭子的IAV阳性率(7.5%;138/1,839)显著高于泄殖腔拭子的IAV阳性率(5.2%；95/1,839;P10-4),同时咽喉拭子含有的IAV拷贝数也明显高于泄殖腔拭子(106.07 vs.105.54；P10.4)；在IAV阳性家禽样品中,H9N2和H7N9血清亚型分别占56.8%(96/169)和41.4%(70/169)。本研究建立的一步反转录FRET-qPCR方法灵敏度高,能快速方便地检测出所有常见IAV血清亚型,为甲型流感的监测和防控提供重要参考和技术支撑。
【关键词】：一步反转录FRET-qPCR 甲型流感病毒 活禽市场 家禽拭子样品
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 符号说明9-10
• 第一章 文献综述10-26
• 1 甲型流感病毒的研究进展10-14
• 1.1 概述10-12
• 1.2 甲型流感病毒的结构12-13
• 1.3 甲型流感病毒的抗原变异13-14
• 2 甲型流感病毒的诊断技术14-18
• 2.1 病原学诊断技术14-15
• 2.2 血清学诊断技术15-16
• 2.3 分子生物学诊断技术16-18
• 3 活禽市场的甲型流感病毒现状18-19
• 4 参考文献19-26
• 第二章 一步反转录FRET-qPCR检测甲型流感病毒方法的建立26-50
• 前言27-28
• 1 材料28-29
• 1.1 病毒株、鸡胚和拭子样品28
• 1.2 主要试剂28
• 1.3 主要仪器28-29
• 2 方法29-38
• 2.1 全核酸的提取29-30
• 2.2 基于基质蛋白基因一步反转录FRET-qPCR方法的建立30-33
• 2.3 FRET-qPCR方法灵敏度测定33-35
• 2.4 FRET-qPCR方法与EID_(50)试验敏感性比较35-36
• 2.5 FRET-qPCR方法特异性验证36
• 2.6 FRET-qPCR方法的可行性探究36-37
• 2.7 基于聚合酶蛋白基因反转录PCR方法的建立37-38
• 3 结果38-45
• 3.1 检测甲型流感病毒一步反转录FRET-qPCR方法38-41
• 3.2 FRET-qPCR方法敏感性测定41-44
• 3.3 FRET-qPCR方法特异性验证44
• 3.4 FRET-qPCR方法的可行性探究44-45
• 3.5 反转录PCR方法进一步验证45
• 4 讨论45-47
• 5 参考文献47-50
• 第三章 一步反转录FRET-qPCR检测甲型流感病毒方法的应用50-61
• 前言51-52
• 1 材料52-53
• 1.1 咽喉和泄殖腔拭子样品52
• 1.2 主要试剂52
• 1.3 主要仪器52-53
• 2 方法53-54
• 2.1 全核酸的提取53
• 2.2 FRET-qPCR方法的应用53
• 2.3 甲型流感H9N2、H7N9和H5N1血清亚型的验证53
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳检测及测序分析53
• 2.5 统计分析53-54
• 3 结果54-56
• 3.1 活禽市场中家禽的IAV流行率54
• 3.2 活禽市场中家禽的3种IAV血清亚型分布54-56
• 3.3 家禽咽喉及泄殖腔拭子中3种IAV血清亚型分布56
• 4 讨论56-57
• 5 参考文献57-61
• 全文总结61-62
• 致谢62-63
• 攻读学位期间发表的学术论文目录63-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：723660