牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的研究

发布时间：2017-08-24 17:46

  本文关键词：牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的研究

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【摘要】：牛支原体病是由牛支原体引起的一种可导致多种病症的传染病。为了快速准确的诊断该病,本研究在参考国内外文献的基础上,选取OPPD /F作为特异性基因,设计合成引物和探针,建立了牛支原体1aqMan实时荧光定量PCR检测方法。目的：本研究旨在建立一种快速检测牛支原体的实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据GenBan k中收录的牛支原体OPPD/F基因序列(登录号：AF130119),利用Primer 5.0软件设计特异性引物与TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量的模板,构建检测牛支原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果：所构建的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.994,扩增效率E=1.28。荧光定量PCR法检测的敏感性是常规PCR的10倍；特异性良好,检测9种相关细菌和病毒均为阴性；重复性好,组内及组间样本检测Ct值均小于2%。结论：牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法较之于常规PCR方法有快速、特异性强、敏感性高、稳定性好的优点。
【关键词】：牛支原体 OPPD/F基因 实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.62
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-21
• 1.1 牛支原体病简介10-11
• 1.2 牛支原体的病原学特性11-12
• 1.2.1 牛支原体的形态特征11
• 1.2.2 牛支原体的基因组学11
• 1.2.3 牛支原体的生长及繁殖特性11-12
• 1.2.4 牛支原体的理化特性12
• 1.3 牛支原体病的流行病学12-13
• 1.4 牛支原体病的临床症状13-14
• 1.4.1 最急性13-14
• 1.4.2 急性14
• 1.4.3 慢性14
• 1.5 牛支原体病的病理变化14
• 1.6 牛支原体病的致病机理14-15
• 1.7 牛支原体病的免疫机理15
• 1.8 牛支原体病的诊断15-17
• 1.8.1 病原的分离培养15-16
• 1.8.2 血清学诊断16
• 1.8.3 分子生物学诊断方法16-17
• 1.9 牛支原体病的治疗17
• 1.10 牛支原体病的防控措施17-18
• 1.10.1 加强饲养管理17-18
• 1.10.2 加强消毒工作18
• 1.10.3 加强检疫监管18
• 1.11 牛支原体病疫苗研究进展18-19
• 1.12 实时荧光定量PCR19-20
• 1.12.1 实时荧光定量PCR简介19
• 1.12.2 实时荧光定量PCR的类别19-20
• 1.13 本研究的目的及意义20-21
• 2 材料与方法21-27
• 2.1 材料21
• 2.1.1 菌株、病毒株及病原核酸21
• 2.1.2 牛支原体病病牛鼻拭子临床样本21
• 2.1.3 主要实验仪器21
• 2.1.4 主要实验试剂21
• 2.1.5 引物和探针21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 牛支原体基因组DNA的提取22
• 2.2.2 牛支原体种属特异性片段(OPPD/F)的扩增22
• 2.2.3 目的片段的回收22-23
• 2.2.4 目的片段与克隆载体的连接及转化感受态trans5α23
• 2.2.5 重组质粒提取及鉴定23-24
• 2.2.6 重组阳性质粒拷贝数测定24
• 2.2.7 荧光定量PCR反应体系及条件的优化24-25
• 2.2.8 实时荧光定量PCR标准曲线的建立25
• 2.2.9 实时荧光定量PCR的敏感性试验25
• 2.2.10 荧光定量PCR的特异性试验25-26
• 2.2.11 荧光定量PCR的重复性试验26
• 2.2.12 实时荧光定量PCR方法临床样品检测26-27
• 3 结果27-33
• 3.1 重组质粒标准品的制备及鉴定结果27-28
• 3.1.1 常规PCR的扩增结果27
• 3.1.2 重组质粒鉴定结果27-28
• 3.1.3 目的片段测序鉴定结果28
• 3.1.4 质粒拷贝数计算结果28
• 3.2 实时荧光定量PCR反应体系的建立结果28-33
• 3.2.1 TaqMan实时荧光定量PCR反应体系及反应参数的优化结果28-29
• 3.2.2 TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线绘制结果29
• 3.2.3 TaqMan实时荧光定量PCR敏感性试验结果29-30
• 3.2.4 TaqMan实时荧光定量PCR特异性试验结果30
• 3.2.5 TaqMan实时荧光定量PCR重复性试验结果30-32
• 3.2.6 临床样品检测结果32-33
• 4 讨论33-35
• 5 结论35-36
• 致谢36-37
• 参考文献37-42
• 作者简介42

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