牛分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）的黏附功能鉴定

发布时间：2017-08-27 22:16

  本文关键词：牛分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）的黏附功能鉴定

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【摘要】：牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(M.bovis)引起的一种慢性、消耗性人兽共患病,给畜牧业发展和公共卫生带来了严重的危害。HBHA蛋白是牛分枝杆菌hbha基因编码的一种表面蛋白,是毒力因子之一,M.bovis对细胞的黏附能力是其毒力的重要指标之一,是建立感染的先决条件。因此本试验对HBHA的黏附功能进行研究:1.HBHA的原核表达、多抗制备及黏附性试验。以M.bovis valleeⅢ基因组DNA为模板,PCR扩增hbha基因,构建重组质粒pET28a(+)-hbha,转化至Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为28 ku,主要以可溶形式表达。用镍柱纯化HBHA蛋白至电泳出现单一条带,浓度为3.6μg/μL。加弗氏佐剂乳化,免疫新西兰大白兔制备多抗,经过Western-blot分析,可以与M.bovis全菌蛋白反应,表明其具有抗原性。将HBHA和A549细胞共孵育,荧光显微镜观察,HBHA蛋白能够黏附于A549细胞表面。2.重组耻垢分枝杆菌HBHA-mc2155的构建及黏附功能鉴定。构建重组质粒pMV361-hbha,电转化至耻垢分枝杆菌mc2155,并用Western-blot验证表达,结果显示在分子量约为28 ku处可见单一条带,表明HBHA在mc2155中成功表达。以His mAb为一抗,羊抗兔IgG-FITC为二抗,荧光显微镜观察,该蛋白表达在HBHA-mc2155膜表面。将HBHA-mc2155与A549细胞共孵育,以His mAb为一抗,以羊抗鼠IgG-FITC为二抗,HBHA多抗为阻断剂,进行黏附及黏附抑制试验,荧光显微镜观察,HBHA-mc2155可黏附于A549细胞表面,HBHA多抗可阻断其黏附。以A549为试验细胞,HBHA-mc2155和mc2155平行进行黏附试验,以兔抗mc2155全菌多抗为一抗,羊抗兔IgG-FITC为二抗,流式细胞术检测A549细胞,计算可知黏附率达到49%。黏附和黏附抑制试验结果发现,与mc2155相比,HBHA-mc2155黏附A549细胞的能力明显提高,而这种黏附能力的升高可被HBHA所抑制。3.HBHA-mc2155的动物致病性试验。以BALB/c小鼠为动物模型,将HBHA-mc2155和mc2155经腹腔免疫小鼠,30 d后取小鼠肺脏做石蜡切片,HE染色镜检,结果表明,与mc2155相比,HBHA-mc2155能造成小鼠肺泡隔明显增宽,肺泡内淋巴细胞浸润等变化。
【关键词】：牛分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 黏附素 HBHA蛋白
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• Summary5-7
• 缩略语表7-11
• 第一篇 文献综述11-18
• 1 牛结核病的病原学11-12
• 2 国内外牛结核病的地域分布以及流行情况12-14
• 2.1 发达国家牛结核病的分布及流行情况12-13
• 2.2 发展中国家牛结核病的流行情况13
• 2.3 我国的牛结核病流行情况13-14
• 3 牛结核病的危害14-15
• 4 牛分枝杆菌致病机理及致病性15
• 5 牛分枝杆菌免疫机理15-16
• 6 牛结核病的防制16
• 7 hbha基因研究进展16-17
• 8 本课题研究及意义17-18
• 第二篇 试验部分18-46
• 第一章 牛分枝杆菌hbha基因的克隆表达及黏附性试验18-34
• 1 材料与方法18-29
• 1.1 材料18-21
• 1.2 M.bovis基因组的提取21
• 1.3 M.bovis hbha基因引物设计21
• 1.4 M.bovis hbha基因的扩增21
• 1.5 hbha基因的PCR扩增产物纯化21-22
• 1.6 pET28a(+)载体质粒的提取22-23
• 1.7 hbha基因回收产物与pET28a(+)表达载体双酶切23
• 1.8 大肠杆菌DH5α 感受态的制备23
• 1.9 hbha基因回收产物与pET28a(+)表达载体的连接转化23-24
• 1.10 HBHA蛋白原核表达及纯化24-26
• 1.11 HBHA多克隆抗体的制备26-27
• 1.12 HBHA多克隆抗体效价的检测27
• 1.13 HBHA的Western blot验证27-28
• 1.14 A549细胞的培养与传代28
• 1.15 HBHA蛋白的黏附性检测28-29
• 2 结果29-33
• 2.1 hbha基因PCR扩增结果29
• 2.2 pET-hbha重组表达质粒的鉴定29-30
• 2.3 rMbHBHA的SDS-PAGE电泳分析30-31
• 2.4 HBHA多克隆抗体效价检测31
• 2.5 HBHA的western-blot验证31-32
• 2.6 HBHA蛋白的黏附性检测32-33
• 3 讨论33-34
• 第二章 肝素结合血凝素的黏附功能鉴定34-46
• 1 材料与方法34-40
• 1.1 材料34-35
• 1.2 hbha基因片段与pMV361载体的连接转化35
• 1.3 重组耻垢分枝杆菌HBHA-mc~2155的构建与鉴定35-37
• 1.4 重组蛋白表达的检测37
• 1.5 HBHA蛋白在HBHA-mc~2155中的分布37
• 1.6 HBHA- mc~2155的黏附和黏附阻断试验37-39
• 1.7 HBHA- mc~2155动物致病性试验39-40
• 2 结果40-44
• 2.1 HBHA-mc~2155的鉴定40-41
• 2.2 HBHA蛋白在HBHA-mc~2155中的分布41-42
• 2.3 HBHA-mc~2155对A549细胞的黏附及黏附阻断试验42-43
• 2.4 HBHA-mc~2155对小鼠致病性试验43-44
• 3 讨论44-46
• 全文总结46-47
• 参考文献47-54
• 致谢54-55
• 作者简介55-56
• 导师简介56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郭爱珍;陈焕春;;牛结核病流行特点及防控措施[J];中国奶牛;2010年11期

2 段旭基;张鹏;王波;张淑霞;党如意;杨增岐;;陕西省关中地区奶牛结核病调查[J];中国动物检疫;2009年07期

3 郭开彬;;奶牛结核病流行病学调查研究[J];草业与畜牧;2008年12期

4 苏明权;张建芳;苏哲;岳乔红;杨柳;段艳;刘家云;郝晓柯;;一种新型结核杆菌快速培养促生长剂的研制[J];中国人兽共患病学报;2006年11期

5 李传友;端木宏谨;;结核分枝杆菌黏附素和结核病[J];结核病与胸部肿瘤;2006年01期

6 姜秀云,王春凤,王春芳,何昭阳;牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J];微生物学报;2005年02期

7 刘思国,王春来,张秀华,郭设平,郭洋,邵美丽;牛结核病病原生态学和流行病学研究[J];中国畜牧兽医;2005年03期

8 周丽蓉,罗永艾;结核病血清学诊断的新进展[J];中国实用内科杂志;2005年03期

9 金鑫,苏敬良;人兽共患病专题讲座 人兽共患病的现状与防制(三)——动物结核病[J];动物保健;2004年06期

10 沈跃飞,吴为群,张扣兴,严英硕,谢灿茂,容中生;结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药的分子机制及其快速鉴定[J];中国抗感染化疗杂志;2004年02期

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本文编号：746110