抗沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的研制及初步临床应用

发布时间：2017-08-28 03:07

  本文关键词：抗沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的研制及初步临床应用

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【摘要】：沙门氏菌广泛分布在自然界中,为革兰氏阴性菌,是肠杆菌科属中重要的人畜共患病原菌。目前已确认的沙门氏菌血清型高达2600多种。在畜禽生产养殖中,沙门氏菌污染一直是不可忽视的问题,其中肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)和鸡-雏沙门氏菌(S.gallinarum-pullorum)是禽类养殖中沙门氏菌污染的常见血清型,可引起产蛋鸡生产性能下降、肉鸡逐渐消瘦和雏鸡大量死亡等危害,对养殖业造成巨大的经济损失。本文研究D群沙门氏菌中肠炎沙门氏菌和鸡-雏沙门氏菌特异表达的PEG菌毛,通过PCR扩增该菌毛主要亚单位pegA基因,构建原核表达系统并制备PEG菌毛单克隆抗体,利用玻板凝集方法快速检测肠炎沙门氏菌和鸡-雏沙门氏菌,为判断禽沙门氏菌污染提供依据。本文分三部分进行研究论述：研究一：沙门氏菌PEG菌毛主要亚单位基因pegA的原核表达。根据GenBank中PEG菌毛的全基因序列,设计一对针对菌毛主要亚单位pegA的特异性引物,以鸡白痢沙门氏菌CVCC 526基因组为模板,利用PCR扩增技术大量获得pegA目的基因。基因片段克隆入pMD19-T载体,测序结果表明序列大小为531 bp,符合预计大小且序列未突变。为制备并纯化重组蛋白,将pegA基因片段克隆入带有HIS标签的原核表达载体pET-22b (+)中,构建重组质粒pET-22b (+)-pegA。将筛选好的重组质粒pET-22b (+)-pegA转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,获得大小约为23 KDa的可溶性蛋白。表达的重组蛋白经镍柱试剂盒纯化后,获得浓度约0.83 mg/mL的纯化重组蛋白,命名为rPegA。通过SDS-PAGE和Western blot分析蛋白条带大小和反应特异性,确定制备的融合蛋白为预期目的蛋白。研究二：抗沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的制备。将表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,在细胞融合和三次亚克隆筛选后获得3株稳定分泌的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为1D10,3D12和484。这三株杂交瘤细胞经液氮冻存后复苏,连续传代后效价未降低,稳定性良好。间接ELISA方法测定单抗腹水效价3D12为1：64000。Western blot检测结果表明制备的单克隆抗体均能特异性的与重组蛋白、肠炎沙门氏菌CMCC50336,鸡白痢沙门氏菌CVCC526和鸡伤寒沙门氏菌T63发生反应,而与鼠伤寒沙门氏菌T14和大肠杆菌DH5a均不发生反应。玻板凝集试验结果表明,单抗腹水可以与肠炎沙门氏菌50336,鸡白痢沙门氏菌CVCC 526和鸡伤寒沙门氏菌T63凝集成阳性反应,而与鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌DH5a不产生凝集现象。说明本试验制备的PEG菌毛单克隆抗体具有良好的特异性。研究三：沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的初步临床应用。以PEG菌毛单克隆抗体建立玻板凝集方法,若玻板凝集试验呈阳性,表明被检菌液中含有肠炎沙门氏菌和／或鸡-雏沙门氏菌,反之则无。PEG菌毛单克隆抗体作为检测抗体,玻板凝集方法检测本实验室分离保存的72份沙门氏菌样本,共检测出43份阳性样品；沙门氏菌诊断血清作为平行对照,共检测出45份鸡-雏沙门氏菌和肠炎沙门氏菌阳性样品。沙门氏菌诊断血清和PEG单克隆抗体玻板凝集结果符合率为95.6%(43/45)。本试验研制的沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体介导的玻板凝集方法,对禽养殖业中肠炎沙门氏菌和鸡-雏沙门氏菌的检测和净化有潜在应用价值。
【关键词】：沙门氏菌 菌毛 pegA 原核表达 单克隆抗体 玻板凝集
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 符号说明10-11
• 文献综述11-30
• 综述一 沙门氏菌PEG菌毛研究进展11-15
• 1 PEG菌毛基因进化和推进蛋白分类11-12
• 2 PEG菌毛的分子生物学特征12-13
• 3 PEG菌毛的表达13-14
• 4 PEG菌毛在致病性中发挥的作用14
• 5 未来研究方向14
• 6 展望14-15
• 综述二 沙门氏菌检测方法研究进展15-23
• 1 传统检测方法15-16
• 2 免疫学检测技术16-18
• 3 分子生物学技术18-20
• 4 沙门氏菌其它检测方法20-21
• 5 单克隆抗体在沙门氏菌检测中的应用21-22
• 6 小结22-23
• 参考文献23-30
• 第一章 沙门氏菌菌毛主要亚单位基因pegA的原核表达30-43
• 1 材料31-32
• 1.1 菌株及载体31
• 1.2 培养基和主要试剂31
• 1.3 主要仪器设备31-32
• 2 方法32-37
• 2.1 pegA基因目的片段的扩增32
• 2.2 pMD19-T-pegA重组质粒的构建32-34
• 2.3 pET-22b (+)-pegA重组质粒的构建34-35
• 2.4 pegA基因的表达及SDS-PAGE分析35-36
• 2.5 大量诱导表达重组蛋白及鉴定36-37
• 2.6 Western blot检测纯化蛋白37
• 3、结果37-40
• 3.1 PCR扩增pegA基因37
• 3.2 重组质粒pMD19-T-pegA酶切鉴定37-38
• 3.3 重组质粒pET-22b(+)-pegA菌落PCR鉴定38
• 3.4 重组质粒pMD19-T-pegA和pET-22b(+)-pegA的测序鉴定结果38-39
• 3.5 融合蛋白诱导表达及分析39-40
• 3.6 PegA蛋白量测定40
• 3.7 Western blot鉴定结果40
• 4、讨论40-42
• 参考文献42-43
• 第二章 抗沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的制备43-56
• 1 材料44-45
• 2、方法45-50
• 2.1 抗原的制备45
• 2.2 抗原乳化45
• 2.3 动物免疫45
• 2.4 骨髓瘤细胞SP2/O制备45
• 2.5 饲养细胞的制备45-46
• 2.6 脾淋巴细胞的制备46
• 2.7 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养46-47
• 2.8 杂交瘤细胞株筛选47-48
• 2.9 杂交瘤细胞的复苏48
• 2.10 腹水的制备及效价检测48-49
• 2.11 单抗亚类鉴定49
• 2.12 单克隆抗体特异性检测49-50
• 3、结果50-53
• 3.1 免疫小鼠血清效价检测结果50-51
• 3.2 间接ELISA最佳条件确定51
• 3.3 细胞融合51
• 3.4 腹水纯化及浓度测定51-52
• 3.5 腹水抗体效价52
• 3.6 抗体的亚类鉴定52-53
• 3.7 单克隆抗体稳定性53
• 3.8 单克隆抗体特异性检测53
• 4、讨论53-55
• 参考文献55-56
• 第三章 抗沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的初步临床应用56-61
• 1、材料57
• 1.1 菌株和抗体57
• 1.2 主要试剂57
• 1.3 主要仪器设备57
• 2、方法57-58
• 2.1 冻存菌复苏培养57
• 2.2 PegA单抗介导的玻板凝集方法的临床应用57-58
• 2.3 沙门氏菌诊断血清平行对照58
• 3、结果58-59
• 4、讨论59-60
• 参考文献60-61
• 全文总结61-62
• 致谢62-63

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本文编号：747077