禽致病性大肠杆菌lsr操纵子调控作用研究
本文关键词：禽致病性大肠杆菌lsr操纵子调控作用研究
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【摘要】：禽致病性大肠杆菌(Avain Pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽类严重的呼吸道和全身性感染,由于其广泛的耐药性、复杂的血清型和致病机制,一直制约对该菌的有效防控。密度感应(Qurom Sensing,QS)是细菌通过分泌自诱导物(Autoinducer,AI),并以此进行“交流”,监控群体密度,进而协调基因表达,调控多种生物功能的过程。Lux S/AI-2型密度感应系统广泛存在于革兰氏阴性和阳性菌中,通过产生AI-2信号分子实现对不同种属细菌的生理功能调控。在鼠伤寒沙门氏菌中,AI-2对细菌生理功能的调控是通过lsr操纵子(包含8个基因,分别是lsr K、lsr R、lsr A、lsr C、lsr D、lsr B、lsr F、lsr G)对AI-2的转运、内化实现的,而在APEC中尚未见相关研究,因此,研究lsr操纵子对AI-2的转运、内化的机制,为从QS层面开展对APEC的防控提供新思路。本研究开展了如下研究:1.大肠杆菌MG6155Δlsr B的构建及AI-2内化检测MG1655Δlsr B利用Red同源重组法,构建大肠杆菌MG1655的lsr B缺失株MG1655Δlsr B。运用哈维弧菌BB170菌株对野生株MG1655与缺失株MG1655Δlsr B的AI-2内化动力学进行检测,结果lsr B缺失后,MG1655不能完全内化AI-2,表明在MG1655中,lsr操纵子在AI-2内化、转运过程中发挥重要作用,也为研究APEC中lsr操纵子是否具有类似功能提供重要依据。2.APEC中lsr操纵子同源序列检测为探讨APEC中是否存在lsr操纵子,依据大肠杆菌MG1655的lsr操纵子序列,设计8对引物对APEC O_1、O_2、O_(78)三个血清型共60株分离株进行PCR检测。其中,在22株APEC O_(78)血清型中,lsr操纵子检出率为95.5%;在16株APEC O_1血清型分离株中,lsr操纵子检出率为68.8%;在22株APEC O_2血清型分离株中,lsr操纵子检出率为40.9%。对APEC O_1、O_2、O_(78)三个血清型lsr操纵子的检测结果表明,参与AI-2内化的lsr操纵子在APEC菌株中的分布具有血清型相关型,在APEC O_(78)血清型中检出率最高,而O_2血清型最低。3.APEC的LsrB与AI-2结合验证以APEC菌株APEC94(血清型为O_(78))研究对象,对包含8个基因的lsr操纵子进行测序。将APEC94的lsr操纵子序列与MG1655中lsr操纵子序列进行分析。结果表明,其核苷酸同源性为99%。大肠杆菌MG1655的lsr B基因能编码AI-2受体蛋白,为了研究是否APEC中的lsr B基因具有类似功能,本研究构建了p Cold TF-LsrB表达载体,分别以BL21(DE3)和BL21?lux S(DE3)为宿主菌对APEC的LsrB重组蛋白进行表达、纯化。AI-2结合试验表明,BL21?lux S(DE3)表达的LsrB重组蛋白具有结合AI-2的活性,结合的AI-2分子可通过对蛋白的热变性进行释放。AI-2释放试验表明,BL21(DE3)表达的LsrB重组蛋白能结合内源性(自身产生)的AI-2,能够通过对蛋白热变性释放结合的AI-2。本研究结果表明APEC94的LsrB蛋白具有AI-2结合活性,因此推测在APEC中,具有LsrB样AI-2结合受体。4.APEC的lsr操纵子缺失株构建及生物学特性分析利用同源重组法构建了APEC94的lsr操纵子缺失株APEC94Δlsr(Cm),并对野生株和缺失株的生物学特性进行研究。结果表明,缺失株与野生株相比,其生长曲线及生物被膜形成能力无明显差异(P㧐0.05)。对9日龄樱桃谷鸭的半数致死量测定结果表明,野生株与缺失株的LD50分别为8.66×105和2.55×108 CFU,缺失株毒力下降了约294倍。对9日龄樱桃谷鸭以1.0×109 CFU剂量分别用野生和缺失株进行攻毒,24 h后缺失株和野生株在雏鸭血液中载菌量分别为2.5×104和6.5×102CFU/m L(P㩳0.0001);肝脏内载菌量分别为5.9×108和3.6×105 CFU/m L(P㩳0.0001);脾脏内的载菌量分别为1.9×1010和6.0×105 CFU/m L(P㩳0.0001);肾脏内的载菌量6.1×108、8.1×105 CFU/m L(P㩳0.0001)。表明缺失lsr操纵子后,APEC对宿主的致病性显著降低,推测lsr操纵子对APEC的致病性具有重要的调控作用,具体调节机制有待于进一步研究。本研究结果表明,APEC存在Lsr样AI-2内化操纵子,且该操纵子分布与血清型相关;APEC的LsrB具有AI-2结合活性;lsr操纵子对APEC毒力具有重要的调控作用。本研究将为进一步研究AI-2对APEC的调控作用以及基于群体感应角度开展对APEC的防控提供新思路。
【关键词】：禽致病性大肠杆菌 密度感应 AI-2 AI-2受体 lsr操纵子
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：
- 摘要6-8
- ABSTRACT8-13
- 英文缩略表13-14
- 第一章 引言14-24
- 1.1 禽致病性大肠杆菌研究进展14-17
- 1.1.1 禽大肠杆菌病14
- 1.1.2 禽致病性大肠杆菌的多样性14
- 1.1.3 禽致病性大肠杆菌的致病机制14-15
- 1.1.4 禽致病性大肠杆菌毒力因子研究进展15-16
- 1.1.5 禽致病性大肠杆菌的防治措施16-17
- 1.2 密度感应系统研究进展17-19
- 1.2.1 密度感应概述17-18
- 1.2.2 密度感应系统分类18-19
- 1.3 LUXS/AI-2 型密度感应系统19-24
- 1.3.1 AI-2 的合成19-20
- 1.3.2 AI-2 内化通路的研究进展20-23
- 1.3.3 AI-2 信号分子的应用23-24
- 第二章 大肠杆菌MG1655Δ lsrB缺失株构建及AI-2 内化特性的检测24-31
- 2.1 材料24-25
- 2.1.1 菌株及质粒24
- 2.1.2 主要试剂及培养基24-25
- 2.1.3 主要仪器设备25
- 2.2 方法25-27
- 2.2.1 PCR引物设计25-26
- 2.2.2 MG1655Δlsr缺失株的构建26-27
- 2.2.3 缺失株内化外源AI-2 能力检测试验27
- 2.3 结果27-29
- 2.3.1.MG1655ΔlsrB突变株的鉴定27-28
- 2.3.2 MG1655与MG1655ΔlsrB内化外源性AI-2 的检测28-29
- 2.4 讨论29-31
- 第三章 禽致病性大肠杆菌lsr操纵子的检测31-39
- 3.1 材料与方法31-32
- 3.1.1 菌株31
- 3.1.2 主要试剂31-32
- 3.1.3 主要仪器设备32
- 3.2 方法32-34
- 3.2.1 PCR引物设计32-33
- 3.2.2 菌株培养33
- 3.2.3 PCR扩增禽致病性大肠杆菌不同血清型中的lsr操纵子基因33-34
- 3.3 结果34-37
- 3.3.1 PCR检测APEC的lsr操纵子34
- 3.3.2 lsr操纵子基因在59株禽致病性大肠杆菌中分布统计34-37
- 3.4 讨论37-39
- 第四章 禽致病性大肠杆菌LsrB蛋白与AI-2 的结合活性验证39-48
- 4.1 材料39-40
- 4.1.1 菌株39
- 4.1.2 主要试剂及培养基39
- 4.1.3 主要仪器设备39-40
- 4.2 方法40-43
- 4.2.1 LsrB蛋白表达载体的构建40-41
- 4.2.2 LsrB蛋白表达41-42
- 4.2.3 LsrB蛋白大量表达，纯化42
- 4.2.4 LsrB重组蛋白与AI-2 结合活性验证42-43
- 4.3 结果43-46
- 4.3.1 pCold-lsrB载体鉴定43-44
- 4.3.2 LsrB重组蛋白的表达、可溶性分析及纯化44-45
- 4.3.3 LsrB重组蛋白与AI-2 结合的活性验证45-46
- 4.4 讨论46-48
- 第五章 lsr操纵子缺失及生物学特性分析48-55
- 5.1 材料48-49
- 5.1.1 菌株及质粒48
- 5.1.2 主要试剂及培养基48
- 5.1.3 主要仪器设备48-49
- 5.2 方法49-50
- 5.2.1 PCR引物设计49
- 5.2.2 APEC94 lsr操纵子缺失株的构建49-50
- 5.2.3 APEC94及APEC94Δlsr（Cm）生长曲线测定50
- 5.2.4 生物被膜形成能力检测50
- 5.2.5 APEC94野生株、APEC94Δlsr（Cm）缺失株半数致死量LD50的检测50
- 5.2.6 体内分布50
- 5.3 结果50-53
- 5.3.1 APEC94Δlsr突变株的鉴定50-51
- 5.3.2 生长曲线测定51-52
- 5.3.3 生物被膜形成能力检测52
- 5.3.4 APEC94野生株、APEC94Δlsr（Cm）缺失株LD50的测定52-53
- 5.3.5 体内分布53
- 5.4 讨论53-55
- 第六章 全文结论55-56
- 参考文献56-63
- 致谢63-64
- 作者简历64
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