重组A型FMDV VP1基因减毒沙门菌表达质粒的构建及其黏膜免疫效果

发布时间：2017-08-30 10:45

  本文关键词：重组A型FMDV VP1基因减毒沙门菌表达质粒的构建及其黏膜免疫效果

  更多相关文章： 口蹄疫病毒 VP1蛋白 减毒鼠伤寒沙门菌 活载体疫苗 黏膜免疫

【摘要】：【目的】口蹄疫(foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种具有极高传染性和暴发性的偶蹄动物疫病,可导致患病动物蹄部、口舌及乳房水泡性病变并伴随发热和肿痛的症状。该病可造成家畜生产性能降低以及幼畜极高的致死率,对流行地区的畜牧业及畜产品贸易造成严重的经济损失,因而被世界公认为最重要的高度传染性的偶蹄动物疫病之一。本试验通过构建重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌,诱导产生外源蛋白,为减毒鼠伤寒沙门菌作为FMDV VP1口服活载体疫苗可行性提供研究基础。【方法】(1)将A型FMDV VP1基因克隆后测序,根据减毒鼠伤寒沙门菌的密码子偏好性进行优化,再将其插入表达载体p YA3341之中,将重组质粒p YA3341-VP1采用化学法转入大肠杆菌X6212中,筛选阳性克隆。经PCR与双酶切鉴定正确后,将重组质粒p YA3341-VP1依次转入减毒鼠伤寒沙门菌中间宿主X3730和表达宿主X4550中,在转入X4550后第3.5h加入IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE与Western-blot分析。(2)将上述重组减毒沙门菌经BALB/c小鼠口服免疫2次后于0d、24d、42d、56d采血,进行ELISA抗体检测。【结果】(1)成功构建了重组减毒沙门菌X4550-VP1载体,且表达产物大小为23ku,与预期目的蛋白大小相符,表明FMDV VP1基因在减毒鼠伤寒沙门菌中得到了成功表达。(2)小鼠黏膜免疫实验结果证明血清Ig G较对照组有所升高,PBS对照组与空载体对照组差异不明显,但与灭活疫苗组相比,抗体水平并不理想;血清Ig A相对Ig G水平较低且消失较快。经两次免疫后小鼠的黏膜部位均产生了分泌型s Ig A,证明重组减毒沙门菌在小鼠体内可诱导产生黏膜免疫应答并产生一定的抗体水平,而PBS对照组s Ig A没有显著差异,空载体对照组s Ig A有所上升,可能由于减毒沙门菌诱导机体产生极微弱的黏膜免疫反应所致,提示减毒沙门菌在表达外源蛋白的同时自身也可以发挥免疫佐剂的效用,但相关研究结果还需进一步的实验验证。血清中和抗体检测表明,重组菌还可以刺激机体产生一定水平的中和抗体。【结论】本研究以构建的减毒沙门菌作为载体递呈外源蛋白,通过口服方式用其对小鼠进行免疫后,不仅可诱导小鼠产生一定水平的针对外源蛋白的血清抗体,还可激发机体局部的黏膜免疫反应。虽然产生的抗体水平较灭活完整病毒的疫苗低,但其所具有的可通过口服方式诱导产生黏膜免疫反应、不易散毒安全性高、生产成本较低和具有佐剂效应等优势,使其成为拥有较强竞争力的口蹄疫活载体疫苗候选株。
【关键词】：口蹄疫病毒 VP1蛋白 减毒鼠伤寒沙门菌 活载体疫苗 黏膜免疫
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Summary4-10
• 第一章 绪论10-21
• 1.1 口蹄疫概述10-11
• 1.1.1 口蹄疫病毒的研究现状10-11
• 1.1.2 口蹄疫病毒基因组的结构及功能11
• 1.2 口蹄疫疫苗的研究进展11-15
• 1.2.1 传统疫苗12
• 1.2.2 核酸疫苗12
• 1.2.3 合成肽疫苗12-13
• 1.2.4 亚单位疫苗13
• 1.2.5 活载体疫苗13-14
• 1.2.6 新型减毒疫苗14-15
• 1.3 减毒沙门菌与黏膜免疫15-19
• 1.3.1 黏膜免疫概述15-16
• 1.3.2 沙门菌的生物学特性及其减毒类型16-17
• 1.3.3 沙门菌侵染机制17-18
• 1.3.3.1 沙门菌相关毒力岛及液泡的生物合成18
• 1.3.3.2 沙门菌与宿主产生的应答反应与存活策略18
• 1.3.3.3 上皮细胞途径与非上皮细胞途径18
• 1.3.4 减毒沙门菌作为活载体疫苗的优势18-19
• 1.4 研究目的及意义19
• 1.5 研究内容及方法19-21
• 1.5.1 A型FMDV VP1基因扩增及优化合成及在减毒沙门菌中的表达19
• 1.5.2 重组减毒沙门菌X4550（pYA3341-VP1）黏膜免疫效果分析19-20
• 1.5.3 技术路线20-21
• 第二章 重组A型FMDV VP1基因减毒沙门菌表达质粒的构建及表达21-35
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 毒株、菌株及质粒21
• 2.1.2 主要试剂及工具酶21-22
• 2.1.3 主要仪器及设备22
• 2.1.4 试剂配制22-23
• 2.2 方法23-29
• 2.2.1 PCR引物设计与合成23
• 2.2.2 目的基因VP1的优化合成23
• 2.2.3 pUC57-simple-VP1质粒提取23-24
• 2.2.4 pYA3341质粒提取24
• 2.2.5 目的基因VP1与表达载体pYA3341双酶切片段的回收24-25
• 2.2.6 目的片段VP1与质粒pYA3341的连接25
• 2.2.7 重组质粒的转化25-26
• 2.2.7.1 感受态细胞X6212的制备25-26
• 2.2.7.2 重组质粒转化X621226
• 2.2.8 阳性质粒pYA3341-VP1的提取及鉴定26-27
• 2.2.9 在中间宿主x3730和终末宿主x4550中的转化27-28
• 2.2.9.1 感受态细胞X3730和X4550的制备27
• 2.2.9.2 pYA3341-VP1依次电转化X3730和X455027-28
• 2.2.10 重组菌X4550（pYA3341-VP1）生长曲线测定28
• 2.2.11 重组pYA3341-VP1在X4550中的表达及鉴定28-29
• 2.2.11.1 重组pYA3341-VP1在X4550中的诱导表达28
• 2.2.11.2 重组菌X4550（pYA3341-VP1） 的SDS-PAGE分析28-29
• 2.2.11.3 重组菌X4550（pYA3341-VP1） Western-blot分析29
• 2.3 结果与分析29-33
• 2.3.1 PCR扩增目的片段VP129
• 2.3.2 目的基因VP1序列的分析及优化29-30
• 2.3.3 重组表达质粒pYA3341-VP1在X6212中的鉴定30
• 2.3.4 重组表达质粒pYA3341-VP1在X3730和X4550中的鉴定30-31
• 2.3.5 重组菌生长状况分析31
• 2.3.6 重组减毒沙门菌X4550（pYA3341-VP1）表达外源蛋白分析31-32
• 2.3.7 重组减毒沙门菌X4440（pYA3341-VP1）Western-blot鉴定结果32-33
• 2.4 讨论33-35
• 第三章 重组沙门菌X4550（pYA3341-VP1）对小鼠黏膜免疫试验35-42
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 实验动物35
• 3.1.2 主要设备及试验仪器35
• 3.1.3 主要试剂35
• 3.1.4 菌株及质粒35
• 3.1.5 试剂配制35-36
• 3.2 动物免疫试验36-38
• 3.2.1 重组减毒沙门菌X4550（pYA3341-VP1）与减毒沙门菌X4550（pYA3341）的制备36
• 3.2.2 试验小鼠分组36
• 3.2.3 小鼠黏膜样品的收集及处理36-37
• 3.2.4 免疫小鼠的血清收集37
• 3.2.5 小鼠黏膜样品sIgA的检测37
• 3.2.6 小鼠血清中IgA、IgG的检测37-38
• 3.2.7 小鼠中和抗体测定38
• 3.3 结果38-40
• 3.3.1 免疫小鼠黏膜样品sIgA的检测结果38-39
• 3.3.2 免疫小鼠血液中IgG、IgA的检测结果39-40
• 3.3.3 小鼠中和抗体测定结果分40
• 3.4 讨论40-42
• 全文结论42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-50
• 附录50-51
• 作者简历51-52
• 导师简介52-53

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 李婧静;重组A型FMDV VP1基因减毒沙门菌表达质粒的构建及其黏膜免疫效果[D];甘肃农业大学;2016年

，

本文编号：758868