禽流感病毒H5N1 HA1与鸡IgY Fc片段融合蛋白的表达及粘膜免疫研究

发布时间：2017-08-30 12:10

  本文关键词：禽流感病毒H5N1 HA1与鸡IgY Fc片段融合蛋白的表达及粘膜免疫研究

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【摘要】：在过去的几十年里H5N1型高致病性禽流感(HPAI)不仅给家禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类的健康也带来了极大的威胁。此外,H5N1型禽流感病毒常与其他亚型的流感病毒重组,从而导致禽流感的大规模流行,因此预防H5N1型禽流感势在必行。禽流感病毒主要通过呼吸道或消化道等黏膜感染动物,在预防病原入侵机体时,滴鼻或者口服接种的途径与其他免疫途径相比可以诱导机体产生局部的粘膜免疫和全身性的免疫应答,阻止病原微生物入侵机体抵抗早期的病毒感染。文献报道,FcRn可以介导IgG跨越粘膜屏障,鸡的FcRy也具有类似的功能,同样可以与IgY结合并特异性的转运IgY,本研究将禽流感病毒H5N1的HA1抗原与鸡IgY Fc片段融合,将该融合蛋白辅以粘膜佐剂通过滴鼻免疫鸡发现FcRy能介导IgYFc融合蛋白跨越粘膜屏障进入体内,并能有效激发机体的局部粘膜免疫和全身性免疫反应。所取得的主要结果如下：1.兔抗鸡H5N1 HA1多克隆抗体的制备利用包涵体纯化蛋白的方式纯化GST-HA1融合蛋白,将该纯化蛋白辅以佐剂免疫家兔,制备了兔抗鸡H5N1 HA1的高免血清,其ELISA抗体效价高达1：16000,Western Blot检测结果表明所制备的该多克隆抗体具有良好的特异性。2.pFAST HTb-sHAl-Fc重组质粒的构建及sHA1-Fc融合蛋白的表达及纯化将H5N1的保护性抗原sHA1与鸡IgY Fc片段融合,构建pFAST HTb-sHA1-Fc重组质粒,利用Bac-to-Bac表达系统表达sHA1-Fc融合蛋白并进行纯化。经SDS-PAGE电泳检测,其蛋白大小为82KD,应用Western Blot分别对该融合蛋白的sHA1和Fc片段进行检测,结果显示该蛋白已成功表达,在非还原条件下检测蛋白大小约为160KD,说明该融合蛋白以二聚体的形式存在,具有类似IgY的分子结构。3.禽流感病毒H5N1 HA1融合蛋白跨越呼吸道粘膜屏障的检测分别将生物素标记的sHA1-Fc、GST-HA1融合蛋白和鸡IgY通过滴鼻接种鸡,8h后检测鸡血清中生物素标记蛋白的含量,结果显示与GST-HA1融合蛋白(OD450=0.104)相比,sHA1-Fc融合蛋白(OD450=0.384)能更有效的跨越鸡呼吸道黏膜上皮屏障转运进入血液中,且二者之间存在显著性差异(P0.01)。4.禽流感病毒H5N1 HA1融合蛋白粘膜免疫的研究分别将sHA1-Fc和GST-HA1融合蛋白辅以佐剂CpG-ODN 2006滴鼻免疫鸡后检测免疫相关指标。结果表明各免疫组均能诱导特异性的粘膜免疫和全身性免疫反应,而且sHA1-Fc蛋白所诱导的免疫反应更强：(1)二免后第14d,sHA1-Fc滴鼻组血清中特异性IgY的ELISA抗体(1：5680)和H1抗体(1：103.97)水平均最高,sHA1-Fc滴鼻组的血清特异性IgY ELISA抗体效价显著高于GST-HA1滴鼻组(P0.01),其HI抗体效价与GST-HA1组相比差异显著(P0.05)。(2)二免后第10d,在气管或肺脏冲洗液中,sHA1-Fc滴鼻组特异性SIgA和IgY的ELISA抗体效价均最高,且与各蛋白免疫组相比差异极显著(P0.01),与灭活苗组相比差异显著(P0.05)。(3)二免后第10d,sHA1-Fc滴鼻组IFN-y含量(243.32pg/mL)显著高于与GST-HA1滴鼻组(P0.01)。sHA1-Fc滴鼻组IL-2含量(341.55pg/mL)显著高于其他各免疫组(P0.01),各组之间IL-4含量差异不显著。(4)二免后第10d,sHA1-Fc滴鼻组刺激指数为2.92,显著高于GST-HA1滴鼻组和sHA1-Fc皮下注射组(P0.01)。本研究结果表明FcRy可介导与IgY Fc片段融合的禽流感病毒抗原穿过鸡呼吸道粘膜屏障,并能有效的激发抗禽流感病毒感染的局部粘膜免疫和全身性免疫反应,为开发新型禽流感疫苗提供了理论依据并奠定了良好的基础,为家禽新型粘膜疫苗的研制也提供了一种新的策略。
【关键词】：禽流感病毒H5N1 HA1 FcRy 鸡 滴鼻免疫
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩略语表(Abbreviation)11-13
• 1 文献综述13-20
• 1.1 禽流感13-14
• 1.1.1 禽流感病毒13
• 1.1.2 血凝素蛋白(HA)13-14
• 1.1.3 禽流感疫苗的研究进展14
• 1.2 哺乳动物新生儿Fc受体(FcRn)的研究进展14-15
• 1.2.1 FcRn的分子结构14
• 1.2.2 FcRn的胞转功能14-15
• 1.3 鸡卵黄抗体IgY Fc受体(FcRy)的研究进展15-16
• 1.3.1 鸡卵黄抗体IgY15
• 1.3.2 FcRy的分子结构15-16
• 1.3.3 FcRy与IgY的结合特点16
• 1.4 杆状病毒昆虫细胞表达系统16-18
• 1.4.1 杆状病毒昆虫细胞表达系统的基本原理16-17
• 1.4.2 杆状病毒昆虫细胞表达系统的优势17-18
• 1.5 CpG-ODN18
• 1.6 粘膜免疫18-20
• 2 目的意义20-21
• 3 材料方法21-47
• 3.1 材料21-26
• 3.1.1 菌株、细胞与实验动物21
• 3.1.2 质粒与杆粒21
• 3.1.3 主要药品与试剂21
• 3.1.4 主要仪器21-22
• 3.1.5 主要抗生素与培养基的配制22-23
• 3.1.6 主要试剂的配制23-26
• 3.2 实验方法26-47
• 3.2.1 鸡组织RNA的提取与反转录26-27
• 3.2.2 引物设计27
• 3.2.3 禽流感H5N1 HA1、鸡IgY Fc基因的扩增27-28
• 3.2.4 sHA1-Fc融合基因的扩增28-29
• 3.2.5 重组质粒pMD18-T-sHA1-Fc的构建29-30
• 3.2.6 pFAST HTb-sHA1-Fc重组质粒的转座30-31
• 3.2.7 杆粒Bacmid的提取与鉴定31-33
• 3.2.8 重组阳性杆粒Bacmid转染Sf9细胞33-34
• 3.2.9 杆状病毒的扩增34-36
• 3.2.10 重组sHA1-Fc融合蛋白的表达36
• 3.2.11 GST-HA1融合蛋白的大量表达与纯化36-37
• 3.2.12 抗禽流感病毒H5N1 HA1多克隆抗体的制备37-41
• 3.2.13 非还原条件下sHA1-Fc融合蛋白Western Blot检测41-42
• 3.2.14 HA1融合蛋白跨越鸡呼吸道粘膜屏障的检测42-43
• 3.2.15 滴鼻和皮下接种鸡的免疫效果检测43-47
• 4 结果47-61
• 4.1 禽流感H5N1 HA1、鸡IgY Fc基因的扩增47
• 4.2 sHA1-Fc融合基因的扩增47-48
• 4.3 重组质粒pMD18-T-sHA1-Fc的构建48
• 4.4 pFAST HTb-sHA1-Fc真核表达载体的构建48-49
• 4.5 重组质粒的转座49-50
• 4.6 重组阳性杆粒Bacmid转染Sf9细胞50-51
• 4.7 重组sHA1-Fc融合蛋白的表达51
• 4.8 GST-HA1融合蛋白的大量表达与纯化51-52
• 4.9 抗禽流感病毒H5N1 HA1多克隆抗体的制备52-53
• 4.10 重组sHA1-Fc融合蛋白的表达53
• 4.11 重组sHA1-Fc融合蛋白的纯化与鉴定53-54
• 4.12 非还原条件下sHA1-Fc融合蛋白Western Blot检测54-55
• 4.13 HA1融合蛋白跨越鸡呼吸道粘膜屏障的检测55
• 4.14 融合蛋白接种鸡的免疫效果检测55-61
• 4.14.1 血清中抗禽流感H5N1 HA1特异性抗体IgY的检测55-56
• 4.14.2 血清特异性抗体的HI效价检测56-57
• 4.14.3 呼吸道局部特异性IgY和SIgA的检测57-59
• 4.14.4 脾淋巴细胞增殖实验59
• 4.14.5 血清中细胞因子的检测59-61
• 5 讨论61-64
• 5.1 引物设计61
• 5.2 HA1融合蛋白跨越呼吸道粘膜屏障的转运61
• 5.3 融合蛋白的粘膜免疫61-64
• 6 结论64-65
• 参考文献65-72

【相似文献】

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1 王璋瑜;;蛋白设计实验室公司买下融合蛋白技术实用权[J];生物技术通报;1990年10期

2 张毅,屈贤铭,杨胜利;融合蛋白基因工程应用及研究[J];生物工程进展;2000年03期

3 杨林,李国清,黄葆英,王全忠,龙綮新,王s阏，

本文编号：759209