降低溶酶体α-AMA对SW敏感性的定向改造

发布时间：2017-08-30 13:14

  本文关键词：降低溶酶体α-AMA对SW敏感性的定向改造

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【摘要】：溶酶体α-甘露糖苷酶(lysosomalα-mannosidase,LAM)α-AMA的重要抑制剂苦马豆素(swainsosine,SW)是一种生物碱,主要来源于疯草,动物采食疯草后出现和α-甘露糖苷酶贮积症类似的疯草病,目前对疯草病没有有效的治疗方法。课题组着眼于对山羊溶酶体α-AMA的研究,以期解决动物疯草中毒的问题,在前期的研究中,孔祥雅等通过RT-PCR方法克隆获得了敏感动物山羊LAM(Capra hircas LAM,chLAM)的基因序列(accession no.JN602369),通过生物信息学和分子对接方法对chLAM的蛋白空间结构进行了分析,发现chLAM由A、B、C、D、E五个亚基构成,A、C、D链上的9个保守的氨基酸位点构成其活性中心,并预测A28 W/G和D58 Y/G突变型chLAM对SW的敏感性降低且不影响其对man5的活性。为验证上述预测结果,本研究用重叠延伸PCR法定点突变A28 W/G和D58 Y/G,并且截去不含活性中心的E肽链,将其作为目的基因构建毕赤酵母X33重组表达载体。甲醇诱导重组菌株表达,并分析表达产物的性质。结果如下:1.根据生物信息学预测结果,设计A28 W/G和D58 Y/G定点突变引物,通过重叠延伸PCR方法,获得A28 W/G和D58 Y/G双位点突变的目的基因序列:chLAM-A28-D58,再截去其E肽链,得到截短双位点突变基因chT-A28-D58。2.成功构建了毕赤酵母X33重组表达载体pPICZαA-chLAM和pPICZαA-chT-A28-D58,线性化后电转入毕赤酵母X33野生型菌株中,1%甲醇诱导表达后,从酵母细胞超声破碎上清中得到全长基因表达产物chLAM和截短双位点突变基因表达产物chT-A28-D58,大小分别为107 KDa和87 KDa。3.利用pPICZαA载体上的6×His标签对重组蛋白进行纯化,纯化各洗脱组分通过8%SDS-PAGE凝胶检测,在100 mM咪唑浓度洗脱组分中可获得单一条带的纯化蛋白。对已纯化的chLAM和chT-A28-D58进行western blot检测,PVDF膜在相应分子量区域(107 kDa及87 KDa)可见抗原条带,即为检测的chLAM和chT-A28-D58蛋白条带。4.chLAM的最适作用温度和pH分别为55℃和6.0,chT-A28-D58的最适作用温度和pH则为45℃和6.0。5-10 mM的金属离子Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cr3+对其活性有促进作用,EDTA、Al3+、Co2+对其活性有抑制作用。加入SW后,chT-A28-D58活性下降42.7%,高于chLAM的活性下降比73.5%。
【关键词】：溶酶体α-甘露糖苷酶 基因截短 定点突变 毕赤酵母表达
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 文献综述11-24
• 第一章 Α-甘露糖苷酶研究进展11-24
• 1.1 Α-AMA介绍11-15
• 1.1.1 α-AMA基因11-12
• 1.1.1 α-AMA的分类12-13
• 1.1.2 α-AMA的氨基酸序列13-14
• 1.1.2 α-AMA底物特异性14
• 1.1.3 α-AMA基因突变14
• 1.1.4 α-AMA在抗癌药物的应用14
• 1.1.5 α-AMA在其他方面的应用14-15
• 1.2 Α-AMA结构研究15-20
• 1.2.1 果蝇溶酶体 α-AMA15
• 1.2.2 酿脓链球菌 α-AMA15-19
• 1.2.3 牛溶酶体 α-AMA19-20
• 1.3 Α-AMA酶的改造技术20-22
• 1.3.1 基因截短技术研究20-21
• 1.3.2 基因定点突变技术研究21-22
• 1.4 毕赤酵母表达22-24
• 试验研究24-45
• 第二章 山羊溶酶体 Α-甘露糖苷酶基因的截短双突变24-34
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 主要仪器24
• 2.1.2 主要试剂24
• 2.1.3 试验样品24-25
• 2.1.4 试验菌株及表达载体25
• 2.1.5 培养基25
• 2.2 方法25-28
• 2.2.1 重叠延伸PCR（overlap extension PCR）引物及截短引物设计25-26
• 2.2.2 重叠延伸PCR的反应体系26
• 2.2.3 重叠延伸PCR的反应步骤26
• 2.2.4 获取截短片段chT-A28-D5826-27
• 2.2.5 全长和截短突变 Α-AMA基因的重组酵母表达载体构建27-28
• 2.2.6 Α-AMA基因的毕赤酵母表达28
• 2.3 结果28-32
• 2.3.1 双突变全长片段的鉴定28-29
• 2.3.2 全长双突变基因的截短29-30
• 2.3.3 全长和截短双突变chLAM基因的克隆及测序30-31
• 2.3.4 重组毕赤酵母表达载体的构建31
• 2.3.5 重组酵母菌株基因组的PCR31-32
• 2.4 讨论32-33
• 2.4.1 表达载体的构建32
• 2.4.2 chLAM基因的定点突变位点选择32-33
• 2.5 小结33-34
• 第三章 毕赤酵母表达产物的鉴定、纯化及酶特性的测定34-45
• 3.1 材料34
• 3.1.1 主要试剂34
• 3.1.2 主要仪器34
• 3.2 方法34-37
• 3.2.1 重组酵母菌的诱导表达34
• 3.2.2 毕赤酵母表达产物的样品处理34-35
• 3.2.3 毕赤酵母表达产物的SDS-PAGE鉴定35
• 3.2.4 蛋白质浓度测定35
• 3.2.5 毕赤酵母表达产物的Western-blot鉴定35
• 3.2.6 毕赤酵母表达产物的纯化35
• 3.2.7 表达产物的酶活测定35-36
• 3.2.8 表达产物对SW敏感性测定36
• 3.2.9 表达产物的酶特性分析36-37
• 3.3 结果37-41
• 3.3.1 表达产物的SDS-PAGE检测及纯化37
• 3.3.2 表达产物的蛋白质浓度测定37
• 3.3.3 表达产物的的western blot37-38
• 3.3.4 表达产物的活性检测及其对SW敏感性的检测38-39
• 3.3.5 表达产物的酶特性分析39-41
• 3.4 讨论41-44
• 3.4.1 重组山羊溶酶体 α-AMA对SW敏感性41-42
• 3.4.2 重组酶的表达产量42
• 3.4.3 全长蛋白和截短双突变蛋白的活性测定42
• 3.4.4 表达产物的酶特性分析42-43
• 3.4.5 毕赤酵母表达产物的鉴定43-44
• 3.5 小结44-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 致谢50-51
• 作者简介51

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