J亚群禽白血病病毒受体作用域鉴定及其在不同品种鸡中的比较研究

发布时间：2017-08-30 17:44

  本文关键词：J亚群禽白血病病毒受体作用域鉴定及其在不同品种鸡中的比较研究

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【摘要】：J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)所引起的禽类造血组织中某些细胞成分过度增生的肿瘤性疾病。近些年来,ALV-J在我国本地鸡群中大规模流行,造成严重的经济损失。逆转录病毒感染宿主细胞的过程,首先是病毒囊膜蛋白与病毒细胞受体相互识别,发生相互作用,进而在受体介导下病毒进入宿主细胞。不同亚群的病毒,其细胞受体并不相同。据报道,禽Ⅰ型Na+/H+交换蛋白(Chicken Na+/H+exchanger typeⅠ,chNHE1)为J亚群禽白血病病毒的细胞受体。NHE1基因为看家基因,广泛存在于真核动物细胞膜上。在低pH条件下,ALV-J的囊膜蛋白与chNHE1识别,跨膜区(Transmembrane,TM)发生构象改变,促使囊膜蛋白与细胞膜融合,最终病毒进入细胞内。病毒与其受体的结合是病毒进入乃至感染过程的第一步,具有至关重要的作用。对于病毒与受体相互作用过程的研究,有利于探索病毒感染和致病机制。因而,本研究致力于探索ALV-J的细胞受体chNHE1的关键作用域及其在不同地方品种鸡之间的保守性。首先通过融合表达分泌信号肽的方式实现了gp85蛋白的高效可溶性表达,进而建立了检测受体结合能力的流式细胞分析方法。同时,构建并成功拯救了一株带有Luciferase标记、囊膜蛋白属于ALV-J的RCAS病毒,并利用此重组病毒建立了检测病毒进入水平的实验方法。在此基础性上,进行了chNHE1与人NHE1相应膜外环(Extracellular loop,ECL)及与无关标签HA的替换,通过受体结合实验和病毒进入实验,发现ECL1和ECL3为影响受体功能的关键膜外环。对ECL1进行逐级分段替换,证实了第28-39位氨基酸为影响受体功能的最小区段。对这一区段的12个氨基酸进行了点突变,最终确定30,33,34,38和39五个位点为影响受体功能的关键氨基酸位点。与此同时,通过对ECL3进行分段替换,确定了214/215两个位点协同作用,影响受体结合能力。为了进一步验证所鉴定关键氨基酸的重要作用,以人NHE1为骨架,替换为chNHE1上相应的氨基酸位点及区段。结果发现,第28-39区段能使人NHE1获得结合gp85蛋白能力。这一结果进一步证明了28-39位氨基酸是ch NHE1结合gp85蛋白的关键作用域。流行病学调查发现,不同地方品种鸡之间ALV-J感染率差异显著。为了验证这种差异是否是由于chNHE1作用域发生了变异,本研究从四个养禽大省选择了18个地方品种鸡,进行了chNHE1作用域的测序和比对,发现受体序列完全一致,高度保守。本研究首次鉴定了ALV-J的细胞受体chNHE1上发挥作用的关键区段和位点,并发现受体作用域在不同地方品种鸡中高度保守。这些结果为研究ALV-J感染与致病机制奠定了基础,为ALV-J防控策略的制定提供了新思路。
【关键词】：J亚群禽白血病病毒 作用域 受体 禽Ⅰ型钠氢交换蛋白
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-18
• 1.1 禽白血病12-13
• 1.1.1 禽白血病概况12
• 1.1.2 禽白血病病毒概况12-13
• 1.2 J亚群禽白血病病毒13-14
• 1.2.1 J亚群禽白血病病毒在我国的流行过程13-14
• 1.2.2 J亚群禽白血病病毒的致病性14
• 1.3 病毒受体14-16
• 1.3.1 病毒受体概况14-15
• 1.3.2 禽白血病病毒受体研究进展15-16
• 1.4 J亚群禽白血病病毒受体16-17
• 1.4.1 J亚群禽白血病病毒受体的发现16
• 1.4.2 J亚群禽白血病病毒受体研究进展16-17
• 1.5 本研究的目的和意义17-18
• 第二章 RCAS(J)-Luciferase重组病毒拯救与可溶性gp85蛋白的制备18-28
• 2.1 实验材料18-19
• 2.1.1 细胞与质粒18
• 2.1.2 主要实验试剂18-19
• 2.1.3 主要实验仪器19
• 2.2 实验方法19-23
• 2.2.1 可溶性gp85蛋白的制备19-20
• 2.2.2 流式细胞技术20-21
• 2.2.3 RCAS(J)-Luciferase标签病毒的拯救及生物学功能鉴定21-22
• 2.2.4 受体重建实验22-23
• 2.3 实验结果23-26
• 2.3.1 gp85蛋白的细胞上清表达23
• 2.3.2 受体结合实验方法的建立23-24
• 2.3.3 RCAS(J)-Luciferase标签病毒生物学功能鉴定结果24-25
• 2.3.4 病毒进入实验方法的建立25-26
• 2.4. 讨论26-27
• 2.5. 小结27-28
• 第三章 ALV-J受体作用域研究28-38
• 3.1 实验材料28
• 3.1.1 细胞与病毒28
• 3.1.2 主要实验试剂28
• 3.1.3 主要实验仪器28
• 3.2 实验方法28-30
• 3.2.1 关键膜外环的确定28-29
• 3.2.2 最小功能区段的探索29
• 3.2.3 关键氨基酸的确定29-30
• 3.2.4 功能获得实验30
• 3.2.5 HA标签替换查找关键作用域30
• 3.3 实验结果30-36
• 3.3.1 ECL1为影响受体功能的关键膜外环30-32
• 3.3.2 28-39位氨基酸是影响受体结合能力的最小区段32
• 3.3.3 影响受体功能的关键氨基酸的确定32-34
• 3.3.4 28-39位氨基酸是使人NHE1获得受体功能的最小区段34-35
• 3.3.5 ECL3上 214/215位点协同作用，，影响受体功能35-36
• 3.4 讨论36-37
• 3.5 小结37-38
• 第四章 不同地方品种鸡之间chNHE1作用域序列的比较研究38-45
• 4.1 实验材料38
• 4.1.1 鸡胚与病毒38
• 4.1.2 主要实验试剂38
• 4.1.3 主要实验仪器38
• 4.2 实验方法38-41
• 4.2.1 不同地方品种鸡ALV-J感染率的确定38-39
• 4.2.2 ALV-J受体序列扩增与比对39-41
• 4.2.3 相同鸡场不同品种鸡病毒进入水平的比较41
• 4.3 实验结果41-44
• 4.3.1 不同地方品种鸡ALV-J感染率存在差异41-42
• 4.3.2 不同地方品种鸡chNHE1受体基因序列一致42-43
• 4.3.3 相同鸡场不同品种鸡病毒进入水平没有差异43-44
• 4.4 讨论44
• 4.5 小结44-45
• 第五章 全文结论45-46
• 参考文献46-52
• 附录52-55
• 致谢55-56
• 作者简介56

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本文编号：760745