miR-101作用于ING3的功能研究及对牛核移植胚胎发育的影响
本文关键词：miR-101作用于ING3的功能研究及对牛核移植胚胎发育的影响
更多相关文章： mi R-101 ING3 体细胞核移植 胚胎发育 牛
【摘要】：SCNT(体细胞核移植技术)是现代生物技术的一项关键技术,在家畜优良个体扩繁、转基因技术以及生物制药等方面已广泛应用。然而,目前体细胞核移植因为不完全重编程等因素,克隆动物出生效率低,异常发育个体比例较高,影响SCNT技术的进一步发展,提高核移植重编程效率和促进核移植胚胎的正常发育是目前生物繁殖领域研究的一个热点问题。大量的报道显示,microRNAs在SCNT胚胎早期发育过程中有不可忽略的功能。mi R-101是在牛体细胞和卵母细胞中均高表达的一种miRNA,在癌细胞中miR-101主要调控细胞的凋亡与增殖,而在牛胚胎发育中作用目前还不清楚。为此,本研究以牛皮肤成纤维细胞为研究对象,利用荧光素酶报告分析(Luciferase Reporter assay)和免疫印迹(Western blot)方法验证了miR-101的一个靶基因ING3;用实时定量PCR(Real time PCR)和流式细胞分析(Flow cytometry)等方法研究了miR-101及其靶基因在牛SCNT供核细胞中的作用;最后评估了miR-101对体细胞核移植胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚质量的影响。得到了以下研究结果:1、扩增miR-101对应的脱氧核酸序列和包含预测靶基因种子序列的片段分别插入到PCDH-513-B1过表达载体和PsiCHECKTM-2报告载体的多克隆位点,构建mi R-101-513-B1过表达载体和WT-ING3-PsiCHECKTM-2报告载体,用重叠延伸PCR的方法扩增得到预测靶基因种子序列突变序列,连接到PsiCHECKTM-2报告载体上,得到MUT-ING3-PsiCHECKTM-2报告载体,测序结果表明与预期一致。用上述重组质粒分组共转染293T细胞系(人肾上皮细胞系),荧光素酶报告实验分析miR-101与ING3的3’UTR种子序列的结合作用。表明,miR-101直接靶向作用于ING3的3’UTR序列。瞬时转染miR-101-513-B1于牛成纤维细胞(PCDH-513-B1空载体作为对照),Western blot检测发现,mi R-101可以抑制牛成纤维细胞中ING3蛋白的表达。2、稳定转染筛选了整合miR-101牛成纤维克隆细胞(miR-101-BFF)和空载体(PCDH-513-B1)牛成纤维克隆细胞(513-B1-BFF),利用实时定量PCR、流式分析和细胞增殖曲线测定的方法检测了miR-101和ING3在牛成纤维细胞中的功能。发现mi R-101不仅抑制ING3基因转录水平的表达,同时也抑制相关基因P53、P21、UHRF1、BAX和DNMT3A的表达;流式细胞分析可知miR-101抑制了细胞的凋亡,同时缩短了细胞周期;细胞增殖曲线分析结果显示miR-101-BFF增殖最快,与流式分析结果一致。3、为进一步研究miR-101对SCNT胚胎发育的影响,本研究以miR-101-BFF为试验供核细胞,以513-B1-BFF为对照供核细胞进行体细胞核移植,检测胚胎发育到第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果显示miR-101-BFF组的囊胚率(35.75%)高于对照组(26.06%)(P0.05);通过细胞凋亡染色检测,发现miR-101-BFF组的囊胚凋亡率低于对照组(P0.05);实时定量PCR检测胚胎发育相关基因的表达,结果表明,OCT4和SOX2基因的表达量在miR-101-BFF试验高于均照组(P0.05)。
【关键词】：mi R-101 ING3 体细胞核移植 胚胎发育 牛
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：
- 摘要6-8
- ABSTRACT8-13
- 文献综述13-22
- 第一章 microRNA和体细胞核移植13-22
- 1.1 microRNA与体细胞核移植胚胎早期发育13-16
- 1.1.1 体细胞核移植重编程13-14
- 1.1.2 microRNA在胚胎早期发育中的研究进展14-16
- 1.2 microRNA 101与体细胞核移植胚胎发育16-18
- 1.2.1 microRNA-101的研究进展16-17
- 1.2.2 mi R-101与早期胚胎发育17-18
- 1.3 ING3与体细胞核移植胚胎18-21
- 1.3.1 ING3的研究进展18-20
- 1.3.2 ING3对早期胚胎发育的影响20-21
- 1.4 目的意义21-22
- 实验部分22-57
- 第二章 牛miR-101靶基因的验证22-40
- 2.1 实验材料22-23
- 2.1.1 质粒、菌株与细胞株22
- 2.1.2 试剂22
- 2.1.3 仪器设备22-23
- 2.1.4 溶液配制23
- 2.2 实验方法23-33
- 2.2.1 细胞培养23
- 2.2.2 模板的提取23-24
- 2.2.3 mi R101PCDH513B1过表达载体和预测靶基因报告载体构建24-27
- 2.2.4 构建靶基因MUT-PsiCHECKTM-2 报告载体27-28
- 2.2.5 细胞培养与转染28-29
- 2.2.6 荧光素酶报告系统分析29-30
- 2.2.7 WESTERN BLOT30-33
- 2.3 实验结果33-38
- 2.3.1 mi R-101与预测靶基因 3’UTR结合位点预测33
- 2.3.2 mi R101PCDH513B1过表达载体和 3’UTR- PsiCHECKTM-2 载体构建33-36
- 2.3.3 荧光素酶报告实验36-38
- 2.3.4 Western blot检测miR-101对ING3蛋白表达的影响38
- 2.4 讨论38-39
- 2.4.1 过表达载体与报告载体构建38
- 2.4.2 验证mi R-101的直接靶基因38-39
- 2.5 小结39-40
- 第三章 牛miR-101和靶基因在牛成纤维细胞功能的研究40-49
- 3.1 实验材料40-41
- 3.1.1 质粒和细胞40
- 3.1.2 试剂40
- 3.1.3 仪器设备40-41
- 3.1.4 溶液配制41
- 3.2 实验方法41-44
- 3.2.1 细胞的解冻与培养41
- 3.2.2 细胞电转染41
- 3.2.3 细胞筛选41-42
- 3.2.4 阳性细胞中mi R-101过表达检测42-43
- 3.2.5 mi R-101对靶基因及相关基因转录水平的影响43
- 3.2.6 CCK-8 检测筛选细胞的增殖曲线43-44
- 3.2.7 流式检测筛选细胞的凋亡与周期44
- 3.3 实验结果44-47
- 3.3.1 阳性细胞的筛选44-45
- 3.3.2 mi R101513-B1过表达效率的检测45
- 3.3.3 mi R-101对靶基因及相关基因转录水平的影响45-46
- 3.3.4 牛成纤维细胞增殖曲线测定46
- 3.3.5 流式检测细胞周期与凋亡46-47
- 3.4 讨论47-48
- 3.4.1 mi R-101过表达效率检测47-48
- 3.4.2 mi R-101靶基因及相关基因mRNA水平表达量检测48
- 3.4.3 mi R-101对细胞增殖的影响48
- 3.4.4 mi R-101对细胞周期与凋亡的影响48
- 3.5 小结48-49
- 第四章 miR-101对体细胞核移植胚胎发育的影响49-57
- 4.1 实验材料49-51
- 4.1.1 材料49
- 4.1.2 试剂49
- 4.1.3 仪器49
- 4.1.4 溶液配制49-51
- 4.2 实验方法51-53
- 4.2.1 卵母细胞的采集与体外成熟51
- 4.2.2 体细胞核移植51-52
- 4.2.3 囊胚的凋亡染色52
- 4.2.4 胚胎发育相关基因mRNA水平的表达52-53
- 4.3 实验结果53-55
- 4.3.1 mi R-101对体细胞核移植胚胎发育率的影响53
- 4.3.2 mi R-101对体细胞核移植胚胎质量的影响53-54
- 4.3.3 mi R-101对核移植胚胎发育相关基因表达的影响54-55
- 4.4 讨论55-56
- 4.4.1 mi R-101对体细胞核移植胚胎发育的影响55
- 4.4.2 mi R-101对体细胞核移植胚胎质量的影响55-56
- 4.5 小结56-57
- 全文结论57-58
- 创新点和后续研究58-59
- 参考文献59-68
- 致谢68-69
- 作者简介69
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 洪宗宪;金惠芬;苟三启;;玉米胚胎发育研究[J];甘肃农业科技;1983年03期
2 周长海;金斗峰;;鹌鹑胚胎发育标本的制作方法及应用[J];特产研究;1989年03期
3 吕柳新;余小玲;叶明志;肖振通;;荔枝胚胎发育机制的探讨[J];福建农学院学报;1989年02期
4 张健,吕柳新,叶明志;荔枝胚胎发育研究进展[J];福建农业学报;2001年01期
5 位孟聪;栾正庆;;鸡胚胎发育歌诀[J];中国禽业导刊;2005年21期
6 童永;沈建忠;;盘丽鱼胚胎发育的研究[J];安徽农业科学;2008年07期
7 袁静;任育军;赵洁;;水稻胚胎发育过程相关基因的鉴定(简报)(英文)[J];分子细胞生物学报;2008年03期
8 何登菊;姚俊杰;赵云龙;姜海波;;瓯江彩鲤胚胎发育过程中脂、蛋白及碳水化合物水平的变化[J];动物学杂志;2011年02期
9 杨国辉;杨自忠;李孟然;王志强;宋宇;;红瘰疣螈胚胎发育的初步观察[J];生物学通报;2011年08期
10 孔祥会;王书平;江红霞;聂国兴;李学军;;金鱼胚胎发育过程中免疫相关酶活性及丙二醛含量的变化[J];中国水产科学;2011年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 匡刚桥;梁珂;;神仙鱼胚胎发育研究[A];第三届全国现代生态渔业管理与技术研究[C];2011年
2 周爱国;马建波;龙敏明;梁日深;王超;邹青;陈金涛;邹记兴;;杂交鳢的胚胎发育及胚后发育的初步研究[A];2012年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2012年
3 钱耀森;王培亮;郑小东;杨建敏;李琪;;人工繁育条件下长蛸的生物学特性及胚胎发育[A];中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学会分会第十四次学会研讨会论文摘要汇编[C];2009年
4 洪孝友;朱新平;陈昆慈;潘德博;李凯彬;;美洲鲥胚胎发育的初步观察[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
5 蔡清洁;何文辉;董占营;李鲜鲜;陈再忠;崔丽香;张奥;;清洁虾胚胎发育过程中脂肪酸的变化研究[A];2013年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2013年
6 冯欣璐;姚守秀;米拉;姚秀娟;赵宗胜;;杂交禽、鹌鹑与鸡胚胎发育规律的形态学比较分析[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
7 吴丹;范晶;杨柳;陈时锦;齐丽娜;梁家充;蒋钦扬;蒋和生;;印记基因与胚胎发育[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年
8 夏建红;刘静霞;李志;周莉;桂建芳;;一个新的胚胎发育调控基因的表达图式及其功能研究[A];湖北省遗传学会、江西省遗传学会2006年学术年会暨学术讨论会论文摘要集[C];2006年
9 刘静霞;桂建芳;;银鲫胎球蛋白B基因的克隆及其在胚胎发育过程中的表达图式研究[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
10 姚俊杰;胡先成;赵云龙;段晓伟;安传光;;罗氏沼虾胚胎发育过程中蛋白质含量及氨基酸的组成[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 福建农林大学 宣传部;“荔枝胚胎发育的生理生化与分子机制研究”出成果[N];福建科技报;2004年
2 陈勇;美发现影响胚胎发育新基因[N];光明日报;2005年
3 武安市 继辉;鹅种蛋咋保存[N];河北农民报;2009年
4 刘伯开;鹅种蛋的选择和保存[N];山西科技报;2004年
5 郑卫军;影响甲鱼卵孵化的因素[N];中国渔业报;2008年
6 张乐 徐嫣嫣;浙大利用人类胚胎发育理论寻找攻克癌症新方法[N];中国高新技术产业导报;2001年
7 杨骏 编译;胚胎发育过程信号传递途径[N];大众科技报;2001年
8 记者 胡其峰;蜜蜂胚胎发育机理研究获重要突破[N];光明日报;2014年
9 ;著名生物学家 童第周[N];人民日报;2006年
10 杨玉凤 李小玲 刘剑霞 胡枭;巧用木箱孵甲鱼[N];中国渔业报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 苏广华;藏羚羊与普氏原羚异种克隆胚胎发育的转录组学研究[D];内蒙古大学;2016年
2 卢林杉;miR-291a/b-5p在小鼠着床前胚胎发育的表达变化及作用研究[D];第四军医大学;2014年
3 陈伟;荔枝(Litchi chinensis Sonn．)胚胎发育的生理生化基础[D];福建农林大学;2000年
4 薛璐;人类早期胚胎功能基因组学研究及胚胎发育相关新基因功能初探[D];武汉大学;2010年
5 夏建红;鱼类两个胚胎发育调控基因的表达特征及功能分析[D];中国科学院研究生院（水生生物研究所）;2007年
6 赵栓;干扰素诱导基因15在牛体外卵母细胞成熟及胚胎发育中的作用研究[D];中国农业大学;2014年
7 于建宁;5-脱氧杂氮胞苷对小鼠附植前胚胎发育的影响[D];南京农业大学;2008年
8 李文兰;白菜型油菜胚胎发育过程中转录组和蛋白质组的研究[D];武汉大学;2011年
9 赵杨;cyclin K在卤虫胚胎发育过程中的分子特征及功能研究[D];浙江大学;2012年
10 蒋f^;G蛋白偶联受体激酶在胚胎发育中调控作用的研究[D];复旦大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙尉峻;外源谷胱甘肽对牛体外受精胚胎发育的影响[D];中国农业科学院;2015年
2 赵男;氟化钠对中华大蟾蜍胚胎发育的影响[D];陕西师范大学;2015年
3 张忠杰;家蚕胚胎发育时期无翅基因Wnt1的功能分析[D];江苏科技大学;2015年
4 林海军;胚胎中lncRNA的预测及其在胚胎发育过程中的功能分析[D];南昌大学;2015年
5 陈素英;hＭ种普吵媾咛シ⒂淖饔没沓醪窖芯縖D];西北农林科技大学;2015年
6 李麒麟;团头鲂胚胎发育的转录组分析[D];湖南师范大学;2015年
7 雷翠云;金柑花芽分化和胚胎发育形态研究[D];广西师范大学;2015年
8 陈小娇;三氯生暴露对胚胎发育的影响及机制研究[D];南京医科大学;2013年
9 侯雪宁;暗纹东方渶胚胎发育相关miRNA表达差异研究[D];中国海洋大学;2015年
10 谢荣霞;miR-101作用于ING3的功能研究及对牛核移植胚胎发育的影响[D];西北农林科技大学;2016年
，本文编号：763155
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/763155.html
