MiR-223靶向IGF2和ZEB1调控家禽成肌细胞的增殖和分化

发布时间：2017-09-01 22:30

  本文关键词：MiR-223靶向IGF2和ZEB1调控家禽成肌细胞的增殖和分化

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【摘要】：MicroRNA是一种内源性小分子非编码RNA,广泛存在于真核生物中并参与调控各类细胞进程。大量研究表明,miRNA参与了鸡胚生长发育、神经细胞和肌肉细胞的增殖和分化、细胞迁移、性成熟和免疫应答等一系列生命活动,对肉鸡的生长、发育和代谢具有重要的调控作用。本研究在实验室前期成果的基础上,筛选出miR-223作为研究肉鸡生长性能的候选基因,并以miR-223为切入点,一方面探索miR-223在骨骼肌生长发育中的生物学功能,另一方面研究miR-223及其靶基因作用于骨骼肌细胞增殖和分化的分子机理。论文主要结果如下:1.通过qRT-PCR技术发现miR-223在鸡胚肌肉发育过程中呈先上升后下降的趋势,其中,在肌肉快速发育的12E-17E高表达,说明miR-223参与鸡胚的肌肉发育。2.通过成肌细胞的体外诱导分化实验发现miR-223在成肌细胞分化过程中持续极显著上升(P0.01),说明miR-223可能对成肌细胞的分化具有重要调控功能。3.通过流式细胞术、CCK-8和qRT-PCR检测过表达和干扰miR-223的成肌细胞,结果表明:miR-223在成肌细胞中具有抑制细胞增殖和促进细胞分化的功能。4.利用生物信息学分析和参考文献报道,预测与细胞增殖分化相关的IGF2基因和ZEB1基因为miR-223的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和western blot等试验,确定miR-223能够靶向抑制IGF2和ZEB1基因的表达。5.过表达和干扰IGF2的实验中发现,IGF2基因能够促进家禽成肌细胞的增殖、分裂和分化过程(P0.01);干扰ZEB1基因能够促进家禽成肌细胞的分化(P0.01)。本研究由上述结果得出结论:gga-miR-223靶向IGF2抑制成肌细胞的增殖,靶向ZEB1促进成肌细胞的分化。本论文揭示了miR-223在家禽骨骼肌生长发育中的功能和调控机制,为进一步认识miR-223在细胞增殖、分化和其他生物学进程中的作用提供了依据。
【关键词】：家禽成肌细胞 miR-223 IGF2基因 ZEB1基因 细胞增殖 细胞分化
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S83
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-10
• 1 前言10-15
• 1.1 MiRNA的简介10
• 1.2 MiRNA在肉鸡生长过程中发挥的作用10-12
• 1.3 MiR-223的研究进展12-13
• 1.4 MiR-223潜在靶基因IGF2和ZEB1的研究进展13-15
• 1.5 研究目的和意义15
• 2 材料与方法15-36
• 2.1 实验材料15-18
• 2.1.1 实验动物与细胞15-16
• 2.1.2 主要试剂和配制16
• 2.1.3 分子克隆实验需要的试剂及配制16-17
• 2.1.4 细胞培养需要的试剂及配制17
• 2.1.5 Western blot所需试剂及配制17-18
• 2.1.6 主要仪器及设备18
• 2.2 实验方法18-36
• 2.2.1 鸡胚肌肉组织采样18
• 2.2.2 组织DNA的抽提18-19
• 2.2.3 鸡胚的性别鉴定19
• 2.2.4 RNA抽提及检测19-20
• 2.2.5 qRT-PCR检测miR-223在鸡胚肌肉发育过程中的表达变化20-22
• 2.2.5.1 MiRNA的反转录20-21
• 2.2.5.2 MiRNA的qPCR21
• 2.2.5.3 qPCR的数据分析处理21-22
• 2.2.6 原代成肌细胞的分离培养和鉴定22-23
• 2.2.6.1 原代成肌细胞的分离22
• 2.2.6.2 原代成肌细胞的培养22
• 2.2.6.3 原代成肌细胞的传代培养22
• 2.2.6.4 原代成肌细胞的免疫荧光鉴定22-23
• 2.2.7 鹌鹑成肌细胞系QM-7 的培养23
• 2.2.8 qPCR检测成肌细胞增殖分化过程中miR-223的表达变化23-24
• 2.2.9 MiR-223细胞生物学功能检测24-27
• 2.2.9.1 细胞转染24
• 2.2.9.2 成肌细胞的细胞周期检测24-25
• 2.2.9.3 CCK-8试剂检测细胞增殖情况25
• 2.2.9.4 qPCR检测肌肉分化的标记基因25-27
• 2.2.10 MiR-223的靶标验证27-31
• 2.2.10.1 靶基因的预测27
• 2.2.10.2 双荧光素酶报告载体的构建27-30
• 2.2.10.3 双荧光素酶报告载体的转染30-31
• 2.2.10.4 双荧光素酶活性检测31
• 2.2.11 qRT-PCR检测miR-223对靶基因mRNA水平的影响31-32
• 2.2.12 Western Blot验证miR-223对靶基因蛋白水平的影响32-33
• 2.2.12.1 Western Blot样品的自备32
• 2.2.12.2 样品总蛋白定量32
• 2.2.12.3 Western Blot基本步骤32-33
• 2.2.13靶基因调控细胞增殖和细胞分化的验证33-36
• 2.2.13.1 IGF2过表达载体的构建及鉴定33-34
• 2.2.13.2 IGF2过表达载体的转染及检测34
• 2.2.13.3 IGF2和ZEB1基因干扰片段的合成34-35
• 2.2.13.4 siRNA干扰效率的检测35
• 2.2.13.5 转染siRNA对细胞增殖分化的影响35-36
• 3 结果和分析36-54
• 3.1 MiR-223在鸡胚发育过程中的表达规律36-37
• 3.1.1 鸡胚性别鉴定结果36
• 3.1.2 肌肉组织总RNA抽提结果36-37
• 3.1.3 MiR-223在鸡胚肌肉组织发育过程中的表达变化37
• 3.2 成肌细胞体外诱导分化前后miR-223的表达变化37-40
• 3.2.1 鸡胚成肌细胞的分离和鉴定37-38
• 3.2.2 成肌细胞的增殖和诱导分化38-39
• 3.2.3 qPCR检测成肌细胞诱导分化前后miR-223的表达39-40
• 3.3 MiR-223在成肌细胞中的生物学功能40-44
• 3.3.1 过表达和干扰miR-223的化学合成片段的转染效率检测40
• 3.3.2 MiR-223抑制成肌细胞增殖40-41
• 3.3.3 MiR-223阻滞成肌细胞的细胞周期41-42
• 3.3.4 MiR-223促进成肌细胞分化42-44
• 3.3.4.1 MiR-223促进成肌细胞分化标记基因的表达42-43
• 3.3.4.2 MiR-223促进肌管的形成43-44
• 3.4 MiR-223的靶标验证44-48
• 3.4.1 野生型和突变型靶基因 3’UTR的双荧光素酶报告载体44-45
• 3.4.2 双荧光素酶活性的检测45-46
• 3.4.3 MiR-223与IGF2的靶标效应46-47
• 3.4.4 MiR-223与ZEB1的靶标效应47-48
• 3.5 IGF2促进成肌细胞的增殖和分化48-52
• 3.5.1 IGF2过表达载体和siRNA的准备48-49
• 3.5.2 IGF2促进成肌细胞增殖49-51
• 3.5.3 IGF2促进成肌细胞的分化51-52
• 3.6 ZEB1抑制成肌细胞的分化52-54
• 3.6.1 siRNA干扰ZEB1基因的检测52
• 3.6.2 ZEB1基因对成肌细胞增殖的作用52-53
• 3.6.3 ZEB1抑制肌肉分化标记基因的表达53-54
• 4 讨论54-59
• 4.1 MiR-223在鸡胚发育中的表达规律54-55
• 4.2 MiR-223的生物学意义55-57
• 4.2.1 MiR-223对成肌细胞增殖的作用效果55-56
• 4.2.2 MiR-223对成肌细胞分化的作用效果56-57
• 4.2.3 MiR-223对家禽成肌细胞增殖分化的调控方式57
• 4.3 IGF2与骨骼肌发育57-58
• 4.4 ZEB1与骨骼肌发育58-59
• 5 结论59-61
• 致谢61-63
• 参考文献63-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：774800