高寒草甸优势植物根际促生菌资源评价及菌种鉴定

发布时间：2017-09-03 08:33

  本文关键词：高寒草甸优势植物根际促生菌资源评价及菌种鉴定

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【摘要】：高寒草甸植物具有极其重要的生态作用和经济价值,其生长环境气候变幻莫测,温差大,使其具有强的耐寒及耐旱性,其根际环境较为恶劣,因此,如果能从该区域植物根际筛选出优良的促生菌菌种资源,就可以为后续微生物菌肥的开发和研制提供优质菌源。本研究以高寒草甸典型的优势植物嵩草(Kobresia myosuroides)和珠芽蓼(Polygonum viviparum)为对象,利用钼蓝比色法、乙炔还原法和固相萃取-高效液相色谱法测定、分析和评价根际促生菌株的溶磷、固氮和分泌植物激素特性,并通过形态特征观察、生理生化特性测定以及16S rDNA基因序列分析相结合的方法鉴定了优良促生菌株的菌种。获得如下结果:(1)从高寒草甸优势植物嵩草和珠芽蓼根际分离并初步筛选出细菌菌株68株,经过二次复筛,最终确定了43株植物根际细菌菌株。统计细菌菌株在植物根际不同部位的分布情况,发现均呈现根系表面明显多于根内和根表土壤的分布趋势。(2)从43株根际细菌菌株中筛选出能够溶解无机磷菌株17株,能够溶解有机磷菌株23株。利用钼蓝比色法定量测定了菌株溶磷量,结果发现,溶解无机磷菌株的溶磷量9.39~94.79μg·m L-1,其中溶磷量最大的是分离自嵩草根际的ZNRS2菌株,其次是SNRP2菌株,各菌株溶解无机磷的能力差异显著(P0.05);溶解有机磷菌株的溶磷量10.37~72.82μg·m L-1,其中溶磷量最大的是分离自嵩草根际的SKHP3菌株,其次是SKRP2菌株,各菌株溶解有机磷的能力差异显著(P0.05)。(3)从43株根际细菌菌株中筛选出具有固氮能力菌株30株,利用乙炔还原法定量测定了菌株固氮酶活性。结果表明,固氮菌株固氮酶活性3.79~3193.07nmol(C2H4)·h-1·m L-1,固氮酶活性最高的是菌株SKRP2,固氮酶活性大于100.00nmol(C2H4)·h-1·m L-1的菌株有3株,分别为SKRP1、SNHP1和ZNRS3。固氮菌株中固氮酶活性小于100.00 nmol(C2H4)·h-1·m L-1的菌株共有27个,占固氮菌总数量的90%。(4)建立了1种可以同时分离分析3种植物激素(吲哚-3-乙酸、赤霉素和玉米素)的固相萃取-高效液相色谱法,并用此方法成功检测到了43株根际细菌发酵产物中3种植物激素的含量。结果表明,植物激素在菌株发酵产物中都很微量,数量级均在102μg·mL-1。这43株细菌菌株都具有分泌植物激素的能力,其中有37.21%的菌株可以同时分泌3种植物激素,有44.19%的菌株可以同时分泌2种植物激素。促生菌株分泌植物激素的能力大小为:玉米素赤霉素吲哚-3-乙酸。对2种植物根际具有分泌植物激素能力的促生菌分布情况进行统计发现,根系表面菌株的分布数量显著多于根内和根表土壤。(5)菌株ZNRS2、SNRP2、ZKHP3和ZKRP1可以作为优质的溶磷菌菌种资源;菌株SKRP2、SNHP1和ZNRS3可以作为优质的固氮菌菌种资源;菌株SKHP3、ZNHP2、ZKRS2、ZKRP1和ZKRP2可以作为优质的分泌植物激素菌菌种资源;综合分析43株根际促生菌株溶磷、固氮和分泌植物激素特性的测定结果,筛选出优良促生菌株15株,其中分泌自嵩草的有7株:SNRS1、SNRS2、SNRP2、SKRS1、SKRP2、SKRP3、SKHP3,分离自珠芽蓼的有8株:ZNRS3、ZNRP3、ZNRP4、ZNHP2、ZKRS1、ZKRS2、ZKRP1、ZKRP2。(6)通过对筛选出的15株优良促生菌株形态特征观察、生理生化特性测定以及16S rDNA基因序列分析,鉴定了15株优良促生菌的菌种。结果表明,15株促生菌株均属于芽孢杆菌属,包含3个不同的种,即:短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
【关键词】：高寒草甸 植物根际促生菌 植物激素 固相萃取 高效液相色谱法 溶磷 固氮 菌种鉴定
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S812;Q93
【目录】：

• 摘要3-5
• SUMMARY5-8
• 缩略词表8-12
• 第一章 文献综述12-28
• 1 植物根际促生菌概述12-15
• 1.1 植物根际促生菌概念12-13
• 1.2 植物根际促生菌主要属13
• 1.3 植物根际促生菌促生方式13
• 1.4 植物根际促生菌促生机制13-14
• 1.5 植物根际促生菌促生研究进展14-15
• 2 植物根际促生菌溶磷及固氮特性概述15-17
• 2.1 溶磷特性15-16
• 2.1.1 土壤磷素概述15-16
• 2.1.2 植物根际促生菌溶磷特性研究进展16
• 2.2 固氮特性16-17
• 2.2.1 生物固氮概述16-17
• 2.2.2 植物根际促生菌固氮特性研究进展17
• 3 植物根际促生菌分泌植物激素特性概述17-24
• 3.1 植物激素概述17-18
• 3.1.1 植物激素概念17-18
• 3.1.2 植物激素种类18
• 3.2 植物激素检测方法18-20
• 3.2.1 植物激素检测难点18-19
• 3.2.2 检测方法概述19
• 3.2.3 高效液相色谱法19-20
• 3.3 植物激素前处理方法20-21
• 3.3.1 植物激素化学特性20
• 3.3.2 传统前处理方法20-21
• 3.3.3 固相萃取21
• 3.4 植物根际促生菌分泌植物激素特性研究进展21-24
• 3.4.1 植物根际促生菌分泌生长素研究进展22-23
• 3.4.2 植物根际促生菌分泌其它激素研究进展23-24
• 4 细菌分类鉴定概述24
• 4.1 细菌分类鉴定方法24
• 4.2 16S r DNA基因序列分析法24
• 5 研究目的及意义24-25
• 6 研究内容及技术路线25-28
• 6.1 研究内容25-27
• 6.1.1 高寒草甸植物根际细菌的分离和纯化25-26
• 6.1.2 植物根际细菌溶磷及固氮特性测定26
• 6.1.3 植物根际细菌分泌植物激素特性测定26
• 6.1.4 优良植物根际促生菌的鉴定26-27
• 6.2 技术路线27-28
• 第二章 高寒草甸优势植物根际细菌分离与纯化28-33
• 1 材料与方法28-31
• 1.1 采样区概况28
• 1.2 试验材料28
• 1.3 样品的采集28
• 1.4 培养基28-29
• 1.5 植物根际细菌分离与纯化29-31
• 1.5.1 根表土壤植物根际细菌分离29-30
• 1.5.2 根系表面植物根际细菌分离30
• 1.5.3 根内植物根际细菌分离30
• 1.5.4 植物根际细菌筛选与纯化30-31
• 2 结果与分析31-32
• 2.1 植物根际细菌分离纯化结果31
• 2.2 植物根际细菌分布特征31-32
• 3 讨论与小结32-33
• 3.1 讨论32
• 3.2 小结32-33
• 第三章 植物根际溶磷菌和固氮菌筛选及其特性研究33-45
• 1 材料与方法33-37
• 1.1 供试菌株33
• 1.2 溶磷菌筛选及溶磷特性测定33-36
• 1.2.1 培养基33-34
• 1.2.2 试剂34
• 1.2.3 标准曲线34-35
• 1.2.4 溶磷菌筛选35
• 1.2.5 溶磷特性测定35-36
• 1.3 固氮菌筛选及固氮特性测定36-37
• 1.3.1 培养基36
• 1.3.2 仪器与设备36
• 1.3.3 标准曲线36-37
• 1.3.4 固氮菌筛选37
• 1.3.5 固氮酶活性测定37
• 2 结果与分析37-43
• 2.1 溶磷菌溶磷特性测定37-41
• 2.1.1 标准曲线37
• 2.1.2 溶磷菌筛选37-38
• 2.1.3 溶磷特性测定38-41
• 2.2 固氮菌固氮特性测定41-43
• 2.2.1 标准曲线41
• 2.2.2 固氮菌筛选41-42
• 2.2.3 固氮酶活性测定42-43
• 3 讨论与小结43-45
• 3.1 讨论43-44
• 3.1.1 植物根际溶磷菌溶磷特性43
• 3.1.2 植物根际固氮菌固氮特性43-44
• 3.2 小结44-45
• 第四章 植物根际细菌分泌植物激素特性研究45-55
• 1 材料与方法45-47
• 1.1 供试菌株45
• 1.2 培养基45
• 1.3 试剂45
• 1.4 仪器与设备45
• 1.5 标准品储备液45-46
• 1.6 样品前处理46
• 1.7 高效液相色谱检测条件选择46-47
• 1.7.1 检测波长选择46
• 1.7.2 流动相选择46
• 1.7.3 流动相流速选择46
• 1.7.4 色谱柱柱温选择46-47
• 2 结果与分析47-53
• 2.1 高效液相色谱法定量分析方法建立47-48
• 2.1.1 检测波长47
• 2.1.2 流动相47
• 2.1.3 流动相流速47-48
• 2.1.4 色谱柱柱温48
• 2.2 线性关系考察及检出限、定量限测定48
• 2.3 样品中3种植物激素含量测定48-51
• 2.4 标准品及样品色谱图51-53
• 3 讨论与小结53-55
• 3.1 讨论53-54
• 3.2 小结54-55
• 第五章 优良植物根际促生菌菌种鉴定55-66
• 1 材料与方法55-59
• 1.1 供试菌株55
• 1.2 菌株形态学特征研究55-56
• 1.2.1 试剂55
• 1.2.2 方法55-56
• 1.3 菌株生理生化特性研究56-58
• 1.3.1 培养基及试剂56
• 1.3.2 方法56-58
• 1.4 菌株 16S r DNA基因序列研究58-59
• 1.4.1 设备与试剂58
• 1.4.2 细菌基因组DNA提取58
• 1.4.3 DNA浓度及纯度检测58-59
• 1.4.4 16S r DNA序列PCR扩增59
• 1.4.5 PCR扩增产物检测59
• 1.4.6 16S r DNA序列测定59
• 1.4.7 16S r DNA序列分析及系统发育树构建59
• 2 结果与分析59-65
• 2.1 菌株形态学特征观察59-60
• 2.2 菌株生理生化特性测定60-62
• 2.3 菌株 16S r DNA基因序列分析62-65
• 2.3.1 细菌基因组DNA纯度及浓度分析62
• 2.3.2 细菌 16S r DNA PCR扩增产物的检测62-63
• 2.3.3 16S r DNA基因序列分析63-64
• 2.3.4 系统发育树的构建64-65
• 3 讨论与小结65-66
• 3.1 讨论65
• 3.2 小结65-66
• 第六章 结论与建议66-68
• 1 结论66-67
• 2 建议67-68
• 参考文献68-75
• 个人简介75-76
• 导师简介76-77
• 致谢77-78

【参考文献】

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本文编号：783970