P38MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞GnRH表达中的作用

发布时间：2017-09-03 12:10

  本文关键词：P38MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞GnRH表达中的作用

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【摘要】：糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是一种类固醇激素,其浓度受到下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenocoyical axis,HPA)轴的调控,在维持机体的稳态,调节生殖及免疫等功能中发挥了重要作用。促性腺激素释放激素(Gonadotropin-relesaing horme,GnRH)是一种10肽激素,是繁殖活动最重要的调节激素,主要通过下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)轴来对生殖活动进行调控。在应激情况下,HPA轴主要通过分泌GC影响HPG轴,从而影响生殖,母畜的生殖能力会通过此种方式而下降。星形胶质细胞在整个中枢神经系统中占据重要地位,尤其在生殖、免疫、应激等方面。根据本实验室已完成的工作中,已经在体外证明了星形胶质细胞能够分泌GnRH,然而其受到哪种信号通路的调节仍然未知。GC-GCR是糖皮质激素发挥经典基因组效应的系统,P38 MAPK是与免疫相关的最重要信号通路。但其两者在星形胶质细胞分泌GnRH中发挥怎样的作用,未有相关资料报道。因此,在应激情况下星形胶质细胞分泌GnRH会发生怎样的变化,星形胶质细胞分泌GnRH会受到怎样的调节成为了本实验的研究重点。本实验利用体外培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞,探究P38 MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞的GnRH表达中的作用,其中主要研究内容如下:(1)不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响;(2)GCR在GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH中的作用;(3)P38 MAPK信号通路对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响;(4)P38 MAPK下游核转录因子NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响。(1)为了有效的探究P38 MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞的GnRH表达中的作用,本实验采用1~3日龄的雌性SD新生大鼠,培养原代星形胶质细胞,经过原代培养、纯化和传代培养,获得所需细胞,经星形胶质细胞特异性标记蛋白-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色检验细胞,所得细胞的纯化率达99%以上,可进行后续实验。(2)为了研究不同浓度gc对星形胶质细胞分泌gnrh的影响,以糖皮质激素类似物地塞米松(dex)刺激星形胶质细胞,用10-4mol/l、10-5mol/l、10-6mol/l、10-7mol/l、10-8mol/l的dex分别处理1h、12h、24h、48h后,利用elisa检测不同浓度gc对星形胶质细胞gnrh的分泌情况、利用实时荧光定量pcr检测gnrh的mrna转录水平,并利用westernblot检测在各浓度gc处理下gcr的变化情况,结果显示,1h、12h、24h、48h时10-4mol/l、10-5mol/l、10-6mol/l、10-7mol/l、10-8mol/lgc处理组的蛋白及mrna转录水平均在不同阶段显著高于对照组(p0.05),gcr在各时间段中对10-8mol/l浓度的gc最为敏感,综合分析确定10-8mol/l的gc为最佳的实验处理浓度。(3)为了研究gcr在gc刺激星形胶质细胞分泌gnrh中的作用,通过使用10-8mol/ldex-bsa与dex分别刺激星形胶质细胞,分别设置gc-bsa组、gc组和对照组,用免疫荧光方法检测gcr的激活情况,并利用elisa和实时荧光定量pcr方法对各组gnrh分泌量和mrna转录水平的变化进行检测,结果显示,gc组在1h、24h转录水平显著高于对照组(p0.05),12h、24h的蛋白水平显著高于对照组证明(p0.05),而gc-bsa组在各时间段与对照组相比无显著性差异,证明当gcr激活后能够促进糖皮质激素刺激星形胶质细胞gnrh的分泌。(4)为了研究p38mapk信号通路是否对gc刺激星形胶质细胞分泌gnrh具有调节作用,通过使用10μmol/l的p38阻断剂sb203580及10-8mol/ldex处理,分别设置p38阻断剂组、p38阻断剂+gc组、gc组与对照组,分别处理1h、12h、24h、48h后,检测各组gnrh分泌量、mrna水平的变化及gcr激活情况,结果显示在12h、24h时p38阻断剂+gc组与gc组的蛋白及转录水平均显著高于对照组(p0.05),且p38阻断剂+gc组在mrna转录水平显著高于gc组(p0.05),而在48h时p38阻断剂+gc组仍保持较高的分泌水平显著高于对照组(p0.05),而p38阻断剂组的蛋白与转录水平在各时间段与对照组无显著性差异,综上所述表明,在gcr激活后,阻断p38mapk信号通路对gc刺激星形胶质细胞分泌gnrh具有上调作用。(5)为了研究p38mapk对激活下游核转录因子nf-κb的影响,通过使用10μmol/l的p38阻断剂sb203580及10-8mol/ldex处理,分别设置p38阻断剂组、p38阻断剂+gc组、gc组与对照组,分别处理1h、12h、24h、48h后,并通过westernblot检测不同时间nf-κb(p65)磷酸化情况。结果显示1h、12h时gc处理组的磷酸化p65表达量极显著高于对照组(p0.01),24h时显著高于对照组(p0.05);1h、12h时p38阻断剂组、p38阻断剂+gc组的磷酸化p65表达量极显著低于对照组(P0.01),24 h时、P38阻断剂+GC组显著低于对照组(P0.05);1 h、12 h时P38阻断剂组与P38阻断剂+GC组的磷酸化P65表达量无显著差异(P0.05)。证明经GC处理后的星形胶质细胞的磷酸化P65表达量会增加,在加入P38阻断剂后的星形胶质细胞磷酸化P65表达量会降低,并且该过程不会受到GC的刺激而增加。综上可知,P38 MAPK是引起核转录因子NF-κB磷酸化的关键激酶。(6)为了研究P38 MAPK信号通路下游的NF-κB核转录因子是否对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有调节作用,通过使用10μmol/L NF-κB阻断剂BAY11-7082及10-8 mol/L DEX处理,分别设置NF-κB阻断剂组、NF-κB阻断剂+GC组、GC组与对照组,分别处理1 h、12 h、24 h、48 h后,检测各组GnRH分泌量、mRNA水平的变化及GCR信号通路激活情况,结果显示在12 h、24 h时NF-κB阻断剂+GC组、GC组的蛋白水平显著高于对照组(P0.05),而NF-κB阻断剂+GC组在1 h、12 h、24 h、48 h极显著高于对照组与GC组(P0.01)结果证明,在GCR激活后阻断P38 MAPK信号通路下游的核转录因子NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有上调作用。综上所述,该试验可以得到以下结果:1、糖皮质激素在10-8 mol/L至10-4 mol/L浓度范围内,均能促进星形胶质细胞中分泌GnRH,且糖皮质激素浓度越高这种促进分泌作用时间越长。2、糖皮质激素能够通过激活GCR促进星形胶质细胞分泌GnRH。3、当GCR激活后,阻断P38 MAPK-NF-κB信号通路及对糖皮质激素刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有上调作用,即P38 MAPK-NF-κB信号通路对GCR在星形胶质细胞分泌GnRH的过程中具有抑制作用。4、GCR在糖皮质激素促进星形胶质细胞分泌GnRH中起到主导作用。
【关键词】：糖皮质激素 星形胶质细胞 P38 MAPK NF-κB
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 英文缩略说明7-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 第一章 文献综述14-22
• 1.1 糖皮质激素的作用机制研究进展14-15
• 1.1.1 糖皮质激素发挥功能的经典信号通路14
• 1.1.2 糖皮质激素的抗炎机理及其作用14-15
• 1.1.3 糖皮质激素抑制生殖中的机理15
• 1.2 星形胶质细胞的重要生理功能研究进展15-17
• 1.2.1 星形胶质细胞在损伤应激中的作用16
• 1.2.2 星形胶质细胞在血脑屏障中的作用16-17
• 1.3 促性腺激素释放激素及其受体研究进展17-19
• 1.3.1 GnRH在中枢神经系统中的生理学功能17-18
• 1.3.2 GnRH受体在机体的分布情况18-19
• 1.4 P38 MAPK信号通路与糖皮质激素受体（GCR）的关系19-22
• 1.4.1 P38 MAPK通路在炎症中的调节机制19
• 1.4.2 糖皮质激素受体经典通路与P38 MAPK通路的相互作用19-22
• 第二章 引言22-24
• 第三章 实验材料及方法24-38
• 3.1 试验材料24-28
• 3.1.1 试验动物24
• 3.1.2 主要试剂24-25
• 3.1.3 实验仪器25-26
• 3.1.4 试剂配制26-28
• 3.2 实验方法28-38
• 3.2.1 星形胶质细胞的培养28-29
• 3.2.2 星形胶质细胞的纯度鉴定29-30
• 3.2.3 不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响30-33
• 3.2.4 GCR在GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH中的作用33-34
• 3.2.5 P38 MAPK信号通路对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响34-35
• 3.2.6 P38 MAPK下游NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响35-38
• 第四章 结果与分析38-58
• 4.1 星形胶质细胞的培养38-39
• 4.1.1 星形胶质细胞的原代培养38-39
• 4.1.2 星形胶质细胞传代培养39
• 4.2 星形胶质细胞的纯度鉴定39-40
• 4.3 不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响40-46
• 4.3.1 ELISA检测不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响40-42
• 4.3.2 RT-PCR检测不同浓度GC对星形胶质细胞转录GnRH mRNA的影响42-44
• 4.3.3 Western Blot检测不同浓度GC对星形胶质细胞的GCR的影响44-46
• 4.4 GCR在GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH中的作用46-49
• 4.4.1 免疫荧光观察星形胶质细胞GCR的激活现象46-48
• 4.4.2 ELISA研究GCR激活后对星形胶质细胞分泌GnRH的影响48
• 4.4.3 RT-PCR研究GCR激活后对星形胶质细胞转录GnRH mRNA的影响48-49
• 4.5 P38 MAPK信号通路对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响49-54
• 4.5.1 ELISA研究P38 MAPK对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响49-50
• 4.5.2 RT-PCR研究P38 MAPK对GC刺激星形胶质细胞转录GnRH mRNA的影响50-51
• 4.5.3 免疫荧光研究P38 MAPK阻断后对激活GCR的影响51-53
• 4.5.4 通过Western Blot研究P38 MAPK对激活下游核转录因子NF-κB的影响53-54
• 4.6 P38 下游 NF-κB 对 GC 刺激星形胶质细胞分泌 Gn RH 的影响54-58
• 4.6.1 ELISA研究NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响54-55
• 4.6.2 RT-PCR研究NF-κB对GC刺激星形胶质细胞转录GnRH mRNA的影响55-56
• 4.6.3 免疫荧光研究NF-κB对激活星形胶质细胞GCR的影响56-58
• 第五章 分析与讨论58-62
• 5.1 关于GC最佳浓度的探讨58
• 5.2 关于GCR向细胞核汇聚现象的探讨58-59
• 5.3 P38 MAPK信号通路与GC对星形胶质细胞的作用的关系59
• 5.4 NF-κB核转录因子与GC对星形胶质细胞的作用的关系59-60
• 5.5 选题对生产实践的作用60-62
• 第六章 结论62-64
• 参考文献64-72
• 致谢72-74
• 在读期间发表的文章74

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