应用qPCR研究中药对猪嗜血支原体的体外作用

发布时间：2017-09-04 03:30

  本文关键词：应用qPCR研究中药对猪嗜血支原体的体外作用

  更多相关文章： 猪嗜血支原体 qPCR 体外培养 中药

【摘要】：研究中药体外对M.suis杀灭作用和抑制黏附作用,筛选对M.suis有杀灭或抑制作用的单味中药和复方中药,为临床上预防和治疗M.suis感染提供依据。利用直接镜检法和血液直接PCR法筛选出含M.suis的阳性血液和不含M.suis的阴性血液，，制备M.suis阳性红细胞、M.suis阴性红细胞和M.suis。通过M.suis体外维持培养体系,应用qPCR研究不同培养时间M.suis拷贝数变化、体外不同药物对M.suis拷贝数影响、体外不同药物对M.suis黏附红细胞的影响、不同药物与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响和不同浓度药物与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响。结果显示：(1)在培养期间M.suis拷贝数没有明显变化。(2)8种单味中丹参、秦皮和甘草的杀灭效果较好,杀灭率分别为33.34%、30.21%和30.15%,青蒿、槟榔、黄芩和苦参杀灭率为25.92%、24.48%、22.58%和22.14%,肉桂皮的杀灭效果最差,杀灭率为0.70%,但单味中药整体杀灭效果较差;复方Ⅰ、复方Ⅱ和复方Ⅲ的杀灭率分别为48.95%、39.50%和41.04%。(3)8种单味中药中甘草抑制黏附效果较好,抑制黏附率达到62.18%,丹参、青蒿、槟榔、苦参、秦皮和黄芩的抑制黏附率分别为34.04%、33.09%、26.19%、25.54%、24.70%、22.77%,肉桂皮的抑制黏附率为0;复方Ⅰ的抑制黏附率最高可达82.20%,复方Ⅱ为80.38%,复方Ⅲ为71.79%。(4)青蒿、黄芩、槟榔、甘草、秦皮、苦参、丹参、复方Ⅰ、复方Ⅱ、复方Ⅲ和强力霉素与M.suis作用后可使红细胞上黏附的M.suis拷贝数减少,其中青蒿、黄芩、槟榔、甘草、复方Ⅰ和复方Ⅱ与红细胞作用后也可使红细胞上黏附的M.suis拷贝数减少;肉桂皮分别与M.suis或红细胞作用后红细胞上黏附的M.suis拷贝数没有显著变化。(5)不同浓度的甘草、丹参、青篙、秦皮、复方Ⅰ、复方Ⅱ、复方Ⅲ和强力霉素与M.suis作用后红细胞上黏附的M.suis拷贝数减少,随着浓度的增加,红细胞上黏附的M.suis拷贝数逐渐减少;甘草、青蒿、复方Ⅰ和复方Ⅱ与红细胞作用后红细胞上黏附的M.suis拷贝数减少,随着浓度的增加,红细胞上黏附的M.suis拷贝数逐渐减少。其中秦皮最适浓度为3000μg/mL,其他3种单味中药和3个复方中药最佳浓度均为4000μg/mL。结果表明：(1)体外培养的方法无法使M.suis增殖。(2)青蒿、黄芩、槟榔、甘草、秦皮、苦参、丹参、复方Ⅰ、复方Ⅱ、复方Ⅲ和强力霉素可以增强对M.suis抑制和杀灭作用;青蒿、黄芩、槟榔、甘草、复方Ⅰ和复方Ⅱ也可使红细胞黏附M.suis的能力减弱;肉桂皮与M.suis或红细胞作用后既不能抑制和杀灭M.suis也无法影响红细胞黏附M.suis。(3)随着药物浓度的增加,甘草、丹参、青蒿、秦皮、复方1、复方Ⅱ、复方Ⅲ和强力霉素对M.suis抑制和杀灭作用逐渐增强,其中甘草、青蒿、复方Ⅰ和复方Ⅱ也可使红细胞黏附M.suis的能力逐渐减弱。
【关键词】：猪嗜血支原体 qPCR 体外培养 中药
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S853.74
【目录】：

• 摘要9-11
• 前言11-17
• 1 病原体11-12
• 1.1 分类11
• 1.2 形态结构11-12
• 1.3 理化特性12
• 2 致病过程12-15
• 2.1 黏附12-13
• 2.2 侵入13
• 2.3 营养消耗13
• 2.4 细胞衰亡13-14
• 2.5 免疫病理14
• 2.6 贫血14-15
• 3 实验室检测15
• 3.1 直接镜检法15
• 3.2 清学方法15
• 3.3 分子生物学方法15
• 4 体外培养方法15-16
• 5 研究的目的及意义16-17
• 材料与方法17-27
• 1 材料17-19
• 1.1 病料来源17
• 1.2 主要仪器及设备17
• 1.3 主要试剂及耗材17-18
• 1.4 主要溶液的配制18-19
• 2 方法19-27
• 2.1 中药培养基的制备19-22
• 2.1.1 中药的选择19
• 2.1.2 中药的熬制19
• 2.1.3 药物培养基的制备19-22
• 2.2 M.suis检测22
• 2.2.1 血液悬滴镜检22
• 2.2.2 血液直接PCR22
• 2.3 血液处理22-23
• 2.3.1 M.suis阳性红细胞制备22
• 2.3.2 M.suis阴性红细胞制备22
• 2.3.3 M.suis制备22-23
• 2.4 重组质粒标准品的制备23-24
• 2.4.1 重组菌的扩增23
• 2.4.2 重组质粒DNA的提取23
• 2.4.3 重组质粒浓度测定23-24
• 2.5 M.suis DNA提取24
• 2.6 qPCR方法及标准曲线的建立24-25
• 2.6.1 qPCR方法的建立24
• 2.6.2 qPCR重组质粒标准曲线的建立24
• 2.6.3 样品M.suis DNA qPCR检测24-25
• 2.7 体外不同培养时间对M.suis拷贝数影响25
• 2.8 体外不同药物对M.suis拷贝数影响25
• 2.9 体外不同药物对M.suis黏附红细胞的影响25
• 2.10 不同药物与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响25-26
• 2.10.1 不同药物与M.suis作用后对M.suis黏附影响25-26
• 2.10.2 不同药物与红细胞作用后对M.suis黏附影响26
• 2.11 不同浓度药物与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响26
• 2.11.1 不同浓度药物与M.suis作用后对M.suis黏附影响26
• 2.11.2 不同浓度药物与红细胞作用后对M.suis黏附影响26
• 2.12 数据分析26-27
• 结果27-59
• 1 M.suis的鉴定27-28
• 1.1 血液悬滴镜检27
• 1.2 PCR鉴定27-28
• 2 重组质粒浓度测定28
• 3 qPCR重组质粒标准曲线绘制28-29
• 4 体外不同培养时间对M.suis拷贝数影响29-30
• 5 体外不同药物对M.suis拷贝数影响30-34
• 5.1 单味中药对M.suis拷贝数影响31-32
• 5.2 复方中药对M.suis拷贝数影响32-33
• 5.3 药物对M.suis的杀灭率33-34
• 6 体外不同药物对M.suis黏附红细胞的影响34-37
• 6.1 单味中药对M.suis黏附红细胞的影响34-35
• 6.2 复方中药对M.suis黏附红细胞的影响35-36
• 6.3 药物对M.suis的抑制黏附率36-37
• 7 不同药物与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响37-42
• 7.1 单味中药与M.suis作用后对M.suis黏附影响38-39
• 7.2 复方中药与M.suis作用后对M.suis黏附影响39-40
• 7.3 单味中药与红细胞作用后对M.suis黏附影响40-41
• 7.4 复方中药与红细胞作用后对M.suis黏附影响41-42
• 8 不同浓度药物与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响42-59
• 8.1 不同浓度甘草与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响43-45
• 8.1.1 不同浓度甘草与M.suis作用后对M.suis黏附影响43-44
• 8.1.2 不同浓度甘草与红细胞作用后对M.suis黏附影响44-45
• 8.2 不同浓度丹参与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响45-47
• 8.2.1 不同浓度丹参与M.suis作用后对M.suis黏附影响45-46
• 8.2.2 不同浓度丹参与红细胞作用后对M.suis黏附影响46-47
• 8.3 不同浓度青蒿与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响47-49
• 8.3.1 不同浓度青蒿与M.suis作用后对M.suis黏附影响47-48
• 8.3.2 不同浓度青蒿与红细胞作用后对M.suis黏附影响48-49
• 8.4 不同浓度秦皮与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响49-51
• 8.4.1 不同浓度秦皮与M.suis作用后对M.suis黏附影响49-50
• 8.4.2 不同浓度秦皮与红细胞作用后对M.suis黏附影响50-51
• 8.5 不同浓度复方Ⅰ与M.suis或红细胞后作用对M.suis黏附影响51-53
• 8.5.1 不同浓度复方Ⅰ与M.suis作用后对M.suis黏附影响51-52
• 8.5.2 不同浓度复方Ⅰ与红细胞作用后对M.suis黏附影响52-53
• 8.6 不同浓度复方Ⅱ与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响53-55
• 8.6.1 不同浓度复方Ⅱ与M.suis作用后对M.suis黏附影响53-54
• 8.6.2 不同浓度复方Ⅱ与红细胞作用后对M.suis黏附影响54-55
• 8.7 不同浓度复方Ⅲ与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响55-57
• 8.7.1 不同浓度复方Ⅲ与M.suis作用后对M.suis黏附影响55-56
• 8.7.2 不同浓度复方Ⅲ与红细胞作用后对M.suis黏附影响56-57
• 8.8 不同浓度强力霉素与M.suis或红细胞作用后对M.suis黏附影响57-59
• 8.8.1 不同浓度强力霉素与M.suis作用后对M.suis黏附影响57-58
• 8.8.2 不同浓度强力霉素与红细胞作用后对M.suis黏附影响58-59
• 讨论59-65
• 1 不同培养时间对M.suis拷贝数的影响59
• 2 中药的选择59
• 3 M.suis基因组DNA的提取59-60
• 4 qPCR检测技术60
• 5 体外不同药物对M.suis拷贝数影响和体外不同药物对M.suis黏附红细胞的影响60-61
• 6 单味中药试验和中药单体试验结果的不同61
• 7 去药处理61
• 8 中药药效的分析61-62
• 9 中药对M.suis或红细胞作用分析62-65
• 结论65-67
• 参考文献67-71
• Abstract71-73
• 致谢73

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本文编号：789118