用于诊断四种禽呼吸道疫病病毒可视化芯片的构建及初步应用

发布时间：2017-09-05 11:06

  本文关键词：用于诊断四种禽呼吸道疫病病毒可视化芯片的构建及初步应用

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【摘要】：禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和传染性喉气管炎是鸡群常见的四种呼吸道疫病。它们的发病症状和剖解病理变化相似,病死率较高,给养鸡业带来严重的经济损失。因此,对于四种疫病的鉴别诊断对防控具有重要意义。本研究是在传统基因芯片技术的基础上结合不对称PCR技术,将生物素标记的不对称PCR扩增产物与寡核苷酸芯片杂交,然后与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)包被的链霉亲和素反应,用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)对该杂交体系显色后,阳性信号能够以肉眼可见的棕色斑点呈现。该研究建立的可视化寡核昔酸基因芯片技术可以对禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎进行同时鉴别诊断,为鸡呼吸道疫病的临床诊断提供了新的技术。1.AIV的NP基因重组质粒的构建及寡核苷酸探针的设计根据Genbank中收录的基因序列,对AIV的保守基因NP,设计一对特异性引物,目的片段的长度为272 bp。以分离株H9为材料提取RNA,经反转录得到cDNA。然后以cDNA为模板,经PCR扩增获得NP基因扩增产物。将所获得的PCR产物经胶回收后与pMD19-T载体连接,然后转化到大肠杆菌DH5a,经PCR扩增和核酸序列测定鉴定,成功克隆出AIV-NP基因的重组质粒；同时成功复苏本实验室前期保存的NDV的F基因、IBV的N基因和ILTV的TK基因的冻干重组质粒菌。以AIV-NP、NDV-F、IBV-N和ILTV-TK靶基因核酸序列片段的正义链为模板,用Oligo7.0软件设计两条寡核苷酸探针,长度为40 bρ左右,Tm值为80℃左右,探针经BLAST分析,确定各探针的特异性良好。2. AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片的构建及条件优化基因芯片的制备：用微阵列芯片喷样系统晶芯(?)Smart ArrayerTM 16在尼龙膜上喷制芯片。喷制前先将尼龙膜在超纯水中浸泡30 mmin待干燥后,将寡核苷酸探针与点样缓冲液充分混合,调整探针到合适浓度后,将探针点制到芯片上,待探针完全固定后,在紫外灯下交联30 min,然后将制备好的芯片在4℃下密封保存。不对称PCR扩增技术：优化生物素标记的上游引物与未标记的下游引物的浓度比例,提高扩增的循环次数,控制模板浓度,用高浓度的琼脂糖凝胶在低电压条件下检测扩增的单链情况。结果表明,在反应体系中当生物素标记的上游引物与下游引物在10：1时,所获单链产物最多。芯片制备与检测技术条件的优化：对芯片制备和芯片检测技术中的各项检测条件进行优化。结果表明：当喷样次数为1次；探针浓度为25 μ M；杂交时间为1 h；杂交温度为50℃；浓度为1.0mg/mL Streptavidin HRP Conjugate稀释2000倍;DAB显色时间为5 min时,芯片检测技术的结果最佳,确立了共检芯片技术检测的标准条件。3. AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检可视化芯片的质量评价本研究对构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片进行了特异性、敏感性和保存期研究。结果表明,本研究所构建的芯片特异性良好；敏感性试验结果显示最低可检测出靶基因浓度为1.0×10-5μ g/μl；随机抽取保存不同时间的3张芯片进行检测,结果该芯片在保存180 d时仍可检测；采用本研究所构建的可视化芯片技术和实验室常规的RT-PCR/PCR技术同时对采自川渝地区的96份临床组织样品进行检测,结果两种方法的检测结果符合率为100%。本研究构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片,为鸡病诊断提供了新的技术。
【关键词】：禽呼吸道疫病 不对称PCR技术 寡核苷酸 可视化基因芯片 诊断
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 符号说明9-15
• 第一章 文献综述15-31
• 1. 四种禽呼吸道疾病及其病原学特征15-21
• 1.1 禽流感概述15-16
• 1.1.1 禽流感病毒病原学特征15-16
• 1.1.2 禽流感病毒NP基因的研究16
• 1.2 新城疫概述16-18
• 1.2.1 新城疫病毒病原学特征17
• 1.2.2 新城疫病毒F基因研究17-18
• 1.3 鸡传染性支气管炎概述18-19
• 1.3.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学特征18-19
• 1.3.2 鸡传染性支气管炎病毒N基因研究19
• 1.4 鸡传染性喉气管炎概述19-21
• 1.4.1 传染性喉气管炎病毒病学原学研究20
• 1.4.2 鸡传染性喉气管炎病毒TK基因研究20-21
• 2. 禽呼吸道疾病的常见诊断方法21-25
• 2.1 病毒分离及电镜观察21-22
• 2.2 免疫学诊断方法22-24
• 2.2.1 病毒中和试验22
• 2.2.2 血凝试验及血凝抑制试验22
• 2.2.3 琼脂扩散试验22-23
• 2.2.4 免疫荧光试验23
• 2.2.5 酶联免疫吸附试验23
• 2.2.6 胶体金技术23-24
• 2.3 分子生物学诊断方法24-25
• 2.3.1 聚合酶链式反应(PCR)24
• 2.3.2 实时荧光定量PCR24
• 2.3.3 环介导等温扩增24-25
• 3. 传统基因芯片技术在鸡疫病检测方面的应用25-27
• 3.1 基因表达谱分析25-26
• 3.2 基因分型检测26
• 3.3 疾病诊断26-27
• 4. 可视化芯片应用的研究进展27-30
• 4.1 可视化基因芯片的研究原理27-28
• 4.2 可视化芯片技术的应用研究28-30
• 4.2.1 可视化芯片对蛋白质的检测29
• 4.2.2 可视化芯片对病原微生物的检测29
• 4.2.3 可视化芯片在其他方面的应用29-30
• 5. 本研究的目的与意义30-31
• 第二章 AIV-NP重组质粒的构建及靶基因的复苏31-43
• 1 材料31-32
• 1.1 生物材料31
• 1.2 主要试验仪器31
• 1.3 主要试剂31-32
• 2 方法32-38
• 2.1 AIV的NP基因重组质粒的构建32-36
• 2.1.1 引物设计32
• 2.1.2 AIV基因组的抽提32-33
• 2.1.3 禽流感的RT-PCR及PCR扩增33
• 2.1.4 AIV-NP基因的胶回收33-34
• 2.1.5 AIV-NP基因的连接34
• 2.1.6 AIV-NP基因的转化34-35
• 2.1.7 AIV-NP基因重组质粒鉴定35-36
• 2.1.8 AIV-NP基因重组质粒菌的保存36
• 2.2 靶基因的复苏及验证36-38
• 2.2.1 靶基因的复苏36
• 2.2.2 靶基因的验证36-38
• 3 结果与分析38-40
• 3.1 AIV-NP基因PCR鉴定结果38
• 3.2 AIV-NP基因重组质粒PCR鉴定结果38-39
• 3.3 AIV-NP基因测序及同源性分析结果39-40
• 3.4 靶基因复苏验证结果40
• 4 讨论40-42
• 4.1 靶基因的选择40-41
• 4.2 靶基因长度的选择41
• 4.3 靶基因的验证41-42
• 5 小结42-43
• 第三章 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化芯片的构建及评价43-61
• 1 材料43-44
• 1.1 生物材料43
• 1.2 主要试验仪器43
• 1.3 芯片杂交材料与试剂43
• 1.4 其他主要材料与试剂43-44
• 1.5 临床样品44
• 2 方法44-48
• 2.1 寡核苷酸探针设计和合成44-45
• 2.2 芯片的制备45
• 2.3 不对称PCR引物浓度的优化45-46
• 2.4 可视化芯片检测的步骤46
• 2.4.1 杂交46
• 2.4.2 封闭46
• 2.4.3 酶联46
• 2.4.4 显色46
• 2.5 可视化基因芯片的优化46-47
• 2.5.1 探针基因喷样浓度的选择46-47
• 2.5.2 重复喷样次数的选择47
• 2.5.3 芯片杂交时间的选择47
• 2.5.4 芯片杂交温度的优化47
• 2.5.5 Streptavidin HRP Conjugate浓度的优化47
• 2.5.6 底物(DAB)显色时间的选择47
• 2.6 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检芯片有效性评价47-48
• 2.6.1 芯片检测特异性检验47-48
• 2.6.2 芯片检测灵敏性检验48
• 2.6.3 芯片保存期检验48
• 2.7 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检芯片的初步应用48
• 3 结果与分析48-57
• 3.1 不对称PCR引物比例优化结果48-49
• 3.2 探针基因重复喷样次数选择结果49
• 3.3 寡核苷酸探针喷样浓度选择结果49-50
• 3.4 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化芯片杂交温度的优化结果50-51
• 3.5 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化芯片杂交时间优化结果51-52
• 3.6 Streptavidin HRP Conjugate稀释倍数的优化结果52-53
• 3.7 底物显色时间优化结果53-54
• 3.8 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的有效性54-55
• 3.9 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的特异性55
• 3.10 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的灵敏性55-56
• 3.11 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的保存期56
• 3.12 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检芯片的临床应用56-57
• 4 讨论57-60
• 4.1 关于不对称PCR技术的讨论57-58
• 4.2 关于可视化芯片的条件优化的讨论58
• 4.3 关于可视化芯片质量评价的讨论58-59
• 4.4 关于可视化芯片临床应用的讨论59-60
• 5 小结60-61
• 研究创新点61-62
• 参考文献62-69
• 致谢69-70
• 附录70-75
• 附录一：靶基因序列信息70-72
• 附录二：临床样本信息表72-73
• 附录三：部分临床样本检测结果图73-75
• 攻读硕士期间发表的论文75

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