表达H5亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验

发布时间：2017-09-05 18:21

  本文关键词：表达H5亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验

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【摘要】：H5亚型高致病性禽流感(／vian Influenza, AI)是由A型流感病毒引起禽类的一种急性、高度接触性传染病。H5亚型禽流感病毒的HA基因变异频繁,目前已鉴定出很多分支。近年来,在我国流行的毒株主要集中于Clade2.3.2.1、Clade7.2 和 Clade2.3.4.4分支,因此迫切需要研制与目前流行毒株抗原性相一致的新型疫苗用于H5亚型禽流感的防控。基因重组活载体疫苗因其可以有效的诱导细胞免疫和粘膜免疫应答而被广泛关注。火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)是一种具有广阔应用前景的病毒载体,由于HVT可以冻干保存、使用方便、对鸡无致病性和不影响其生产性能等优点而作为载体被广泛应用于重组病毒的构建。本研究利用同源重组原理,以火鸡疱疹病毒(HVT) FC126疫苗毒株为载体,以其复制非必需区US2为插入位点,构建含EGFP表达盒的转移载体pFR-EGF P,将转移载体pFR-EGFP和HVT基因组共转染CEF,经同源重组获得表达EGFP标记基因的重组病毒rHVT-EGFP。本研究选择三株分别位于Clade2.3.2.1、Clade7.2和Clade2.3.44分支的H5亚型AIV,选择人巨细胞病毒早期启动子(CMV),构建包含HA基因的转移载体pFR-HA-R6、 pFR-HA-R7、pFR-HA-R8。将转移载体与重组病毒rHVT-EGFP的基因组共转染CEF,经同源重组,用HA基因表达盒替换US2区标记基因EGFP,最终获得表达HA基因的重组病毒rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8。重组病毒经PCR和Western-blot试验鉴定,结果表明,三株重组病毒的基因组中均已正确插入HA基因并能够表达HA蛋白。对重组病毒在CEF上的生长特性进行检测,结果显示,重组病毒与HVT FC126疫苗毒株具有相同的复制水平。本研究评价了重组病毒(rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8)针对相应Clade分支H5亚型AIV的免疫保护效果。将200只1日龄SPF鸡随机分成8组。依次为：rHVT-HA-R6组、rHVT-HA-R7组、rHVT-HA-R8组、禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗组、Re-6攻毒对照组、Re-7攻毒对照组、Re-8攻毒对照组和空白对照组,禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗组60只SPF鸡,其余各组均20只。前三组于1日龄时,经颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的相应疫苗,灭活疫苗组于14日龄时,肌肉注射0.25 mL/羽禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗组。分别于7、14、21、28日龄时通过血凝抑制试验(HI)检测H5亚型AIV的抗体效价。除空白对照组外,其余各组于28日龄经滴鼻点眼途径攻毒,rHVT-HA-R6免疫组、Re-6攻毒对照组、从禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗组取20只SPF鸡用HJ-14株AIV进行攻毒,rHVT-HA-R7免疫组、从禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗组取20只SPF鸡用JA-14株AIV进行攻毒,rHVT-HA-R8免疫组、Re-8攻毒对照组、从禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗组取20只SPF鸡用YZ-14株AIV进行攻毒,攻毒剂量均为105EID50。攻毒后继续观察7天,统计各试验组临床症状、发病率、死亡率、抗体消长及排毒规律。结果表明,在整个试验期内,三个重组疫苗免疫组试验鸡的抗体水平呈持续上升的趋势,而攻毒对照组在攻毒之前均未检测到抗体。在H5亚型AIV强毒株攻毒之后,与对照组相比,三个重组疫苗免疫组试验鸡的抗体水平迅速上升。rHVT-HA-R6、 rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8免疫组的攻毒保护率均为100%,所有结果均表明重组病毒对与H5亚型AIV抗原性相一致的强毒株攻击可以提供完全的免疫保护。
【关键词】：禽流感病毒 火鸡疱疹病毒 HA基因 同源重组 免疫效力
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 符号说明11-13
• 第一章 火鸡疱疹病毒的研究进展13-19
• 1 HVT的分子生物学特性13-14
• 2 HVT作为载体的研究进展14-16
• 3 重组病毒的构建方法16
• 4 影响构建重组HVT的主要因素16-17
• 4.1 插入位点的选择16-17
• 4.2 表达外源基因的启动子选择17
• 5 禽流感重组疫苗的研究进展17-19
• 第二章 表达H5亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验19-48
• 1 材料19-21
• 1.1 鸡胚及试验动物19
• 1.2 毒株、菌株和质粒19-20
• 1.3 主要试剂20
• 1.3.1 主要化学试剂20
• 1.3.2 分子生物学试剂20
• 1.4 分子生物学软件20-21
• 1.5 主要仪器21
• 2 方法21-34
• 2.1 转移载体pFR的构建21-25
• 2.1.1 同源臂引物的设计21
• 2.1.2 HVT基因组的获取21-22
• 2.1.3 目的片段的克隆与测序22-23
• 2.1.4 转移载体p-FR的构建23-24
• 2.1.5 转移载体的酶切鉴定24-25
• 2.2 真核表达载体pT-cmv-HA的构建25-27
• 2.2.1 引物设计25
• 2.2.2 病毒的扩增25
• 2.2.3 病毒RNA的提取25
• 2.2.4 RT-PCR25-26
• 2.2.5 PCR产物连接与阳性克隆的鉴定26
• 2.2.6 克隆载体pT-cmv-HA的构建26-27
• 2.3 转移载体pFR-EGFP和pFR-HA的构建27-28
• 2.4 转移载体的鉴定表达28-29
• 2.4.1 载体pFR-EGFP的鉴定28
• 2.4.2 载体pFR-HA-R6、pFR-HA-R7、pFR-HA-8的鉴定28-29
• 2.5 表达绿色荧光蛋白的重组火鸡疱疹病毒构建29-30
• 2.5.1 HVT基因组的提取29
• 2.5.2 表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒拯救29-30
• 2.5.3 重组病毒rHVT-EGFP的纯化30
• 2.6 表达H5亚型AIV HA基因重组HVT的构建30-31
• 2.7 重组病毒的鉴定31-32
• 2.7.1 PCR鉴定31
• 2.7.2 Western-Blot试验鉴定31-32
• 2.7.3 间接免疫荧光试验(IFA)鉴定32
• 2.7.4 重组病毒在CEF生长特性的检测32
• 2.8 重组病毒对H5亚型AIV的免疫保护评价32-34
• 2.8.1 动物试验设计32-33
• 2.8.2 临床症状及剖检病变的观察33
• 2.8.3 排毒检测33-34
• 3. 结果34-46
• 3.1 转移载体pFR的构建34-35
• 3.1.1 同源臂的克隆及鉴定34
• 3.1.2 转移载体pFR的构建与酶切鉴定34-35
• 3.2 转移载体pFR-EGFP的构建与酶切鉴定35
• 3.3 转移载体pFR-EGFP的表达鉴定35-36
• 3.4 重组病毒rHVT-EGFP的构建36
• 3.5 真核表达载体pFR-HA-R6、pFR-HA-R7、pFR-HA-R8的构建36-37
• 3.5.1 HA基因的克隆36-37
• 3.5.2 HA基因表达盒的扩增37
• 3.6 转移载体pFR-HA-R6、pFR-HA-R7、pFR-HA-R8的鉴定37-38
• 3.6.1 酶切鉴定38
• 3.6.2 Western-Blot试验鉴定38
• 3.7 重组病毒rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8的构建38-39
• 3.8 重组病毒rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8的鉴定39-43
• 3.8.1 PCR鉴定39-40
• 3.8.2 间接免疫荧光试验40-41
• 3.8.3 Western-Blot试验41-42
• 3.8.4 重组病毒在CEF上的生长曲线42-43
• 3.9 重组病毒的免疫效力评价43-46
• 3.9.1 HI抗体消长规律43-44
• 3.9.2 攻毒后排毒率44-45
• 3.9.3 发病率和死亡率45-46
• 4. 讨论46-48
• 全文总结48-49
• 参考文献49-54
• 附录54-57
• 致谢57-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 贾伟新;廖明;;从活禽交易的干预效果看我国禽流感的流行与防控[J];中国家禽;2015年22期

2 蒋文明;陈继明;;我国高致病性禽流感的流行与防控[J];中国动物检疫;2015年06期

3 赵冬凤;高轩;刘新文;胡潇;李明义;;表达H5N1亚型禽流感HA-NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建[J];中国动物检疫;2008年04期

4 吴晓丰;马立克氏病病毒的致病机理及疫苗免疫机理[J];动物医学进展;1998年01期

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本文编号：799545