黄曲霉毒素B1降解菌株的筛选鉴定、降解优化与特性研究

发布时间：2017-09-07 08:02

  本文关键词：黄曲霉毒素B1降解菌株的筛选鉴定、降解优化与特性研究

  更多相关文章： 黄曲霉毒素B1 降解菌株 筛选鉴定 发酵优化 降解特性

【摘要】：黄曲霉毒素对畜禽健康与生产有极大危害,危及食物终端人类的安全,因此毒素的解毒研究刻不容缓。生物降解法对原料不造成二次污染、具有较高特异性、同时阻止毒素重新合成,因此是一种高效、安全的去毒方法。本研究从样品中筛选出高效降解的AFB1的菌株,结合表型鉴定、分子鉴定菌株种属；研究其对致病菌的抑制作用、对抗生素的敏感性、对试验动物的毒性作用,评价其安全性；优化菌株的生长条件；对发酵培养基的营养成分、发酵培养条件进行单因素优化,最显著因素进行响应面试验,确定最优发酵条件,使菌株达到最佳降解能力；初步判断高效降解菌株对AFB1的降解机理,确认降解成分所存在的部位；研究温度、蛋白酶K对其稳定性的影响,硫酸铵对活性成分进行粗提取,检测粗酶的降解活性,以下为试验主要的结果：1.香豆素初筛出33株生长良好的菌株。结合HPLC复筛检测得到菌株F6的降解率高达83.2%。菌体、菌落观察及生理生化鉴定判断属于芽孢杆菌,16S rRNA序列比对分析结果,与ATCC700005核苷酸同源性为99.3%,判定F6菌株为蔬菜芽孢杆菌,命名为Bacillus oleronius GXO1 (GenBank KP297896)。2.蔬菜芽胞杆菌GX01对三种肠道致病菌具有良好抑制性,其中对沙门氏菌抑制等级最高,为++。对青霉素类、头孢类、林可胺类药物耐受,对磺胺类、喹诺酮类药物最为敏感,对其余种类试验抗生素具有较高敏感性。灌胃1×l0l0CFU/(mL·kg)剂量以内的蔬菜芽胞杆菌GX01对小鼠的增重、脏体比、血项指标指标及肝脏、肾脏结构均无显著影响。综合上述三项结果说明蔬菜芽胞杆菌GX01的安全性高,具有应用于生产的安全性基础。3.蔬菜芽胞杆菌GX01在25-40℃、pH在5-8区间内的营养肉汤培养基生长良好,34℃、pH为7繁殖力最旺盛；菌株GX01是需氧菌,三角瓶的装液量越大,瓶中菌株的通气量越小,对菌株的繁殖越不利；菌株GX01接种浓度在10%之内,菌株的繁殖力随接菌浓度升高而增长,超过10%接菌浓度后繁殖力受抑制。4.蔬菜芽胞杆菌GX01分别在葡萄糖碳源、牛肉膏氮源、pH为8.0、6%接种量、100/250 mL装液量、发酵48 h、37℃各单因素的条件试验中达到最佳降解效果,10mmo1/L Mg2+促进蔬菜芽胞杆菌GX01对AFB1的降解力,10mmo1/LCu2+、Ca2+ Fe2+、 Mn2+、Zn2+、Al3+、Cd2+不同程度的抑制菌株的降解性能。5.在各单因素优化的基础上,以AFB1降解率作为设计响应值,降解率影响显著的初始pH、接种量、装液量为试验因素,构建的响应面回归模型得出AFB1最高降解率的各因素最佳理论值：初始pH为7.61、接种量6.29%、装液量93.3 mL,试验验证在此优化条件下发酵将AFB1降解率达提升至88.81%。6.发酵液上清液是蔬菜芽胞杆菌GX01对AFB1主要的降解部位,降解活性为83.0%,上清液加热、加蛋白酶K后的降解活性显著下降,仅为16.2%、23.9%,说明蔬菜芽胞杆菌GX01降解AFB1的物质是胞体分泌至胞外的活性酶类。60%饱和度下硫酸铵盐析上清液所沉淀出的粗酶对AFB1的降解性能最高达65.6%。通过分离鉴定得到的蔬菜芽胞杆菌GX01可高效降解AFB1,对其安全性、降解发酵条件优化及降解活性部位的研究为今后的生产应用提供安全依据及发酵理论参考,为该菌株对AFB 1生物降解的深入研究奠定基础。
【关键词】：黄曲霉毒素B1 降解菌株 筛选鉴定 发酵优化 降解特性
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.87
【目录】：

• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-13
• 主要英文缩略语索引13-15
• 第一章 文献综述15-26
• 1.1 黄曲霉毒素的概况15-21
• 1.1.1 黄曲霉毒素的分类与结构15
• 1.1.2 黄曲霉毒素的理化性质15-16
• 1.1.3 黄曲霉毒素的产生与代谢16
• 1.1.4 黄曲霉毒素的危害16-19
• 1.1.5 黄曲霉毒素的污染与限量19-21
• 1.2 黄曲霉毒素的脱毒方法21-25
• 1.2.1 化学脱毒方法21
• 1.2.2 物理脱毒方法21-23
• 1.2.3 生物去毒法23-25
• 1.3 本课题研究意义25-26
• 第二章 AFB1高效降解菌株的筛选、鉴定与安全性研究26-47
• 2.1 材料与方法26-32
• 2.1.1 培养基配制26-27
• 2.1.2 主要试剂药品27
• 2.1.3 主要仪器27-28
• 2.1.4 样品28
• 2.1.5 试验菌株28
• 2.1.6 试验动物28
• 2.1.7 AFB1降解菌株的分离筛选28-29
• 2.1.8 AFB1高效降解菌株的鉴定29-31
• 2.1.9 体外抑菌试验31
• 2.1.10 抗生素敏感性试验31
• 2.1.11 动物毒性试验31-32
• 2.2 结果32-43
• 2.2.1 菌株初筛结果32
• 2.2.2 菌株复筛结果32-33
• 2.2.3 AFB1标准曲线33
• 2.2.4 AFB1的色谱图33-34
• 2.2.5 F6菌株的形态鉴定34-35
• 2.2.6 F6菌株生理生化鉴定35-36
• 2.2.7 分子生物学鉴定结果36-39
• 2.2.8 对致病菌的体外抑制结果39-40
• 2.2.9 药敏试验结果40-41
• 2.2.10 毒性试验结果41-43
• 2.3 讨论43-46
• 2.4 小结46-47
• 第三章 蔬菜芽孢杆菌GX01发酵优化与降解特性研究47-66
• 3.1 材料与方法47-50
• 3.1.1 培养基47
• 3.1.2 主要试剂药品47
• 3.1.3 主要仪器47
• 3.1.4 菌株GX01在NB培养基的生长优化47-48
• 3.1.5 菌株GX01降解AFB1的发酵培养基成分试验48-49
• 3.1.6 菌株GX01降解AFB1的发酵条件试验49
• 3.1.7 降解AFB1的Box-Benhken响应面试验设计49
• 3.1.8 菌株GX01降解AFB1降解特性试验49-50
• 3.2 结果50-63
• 3.2.1 蔬菜芽孢杆菌GX01的生长曲线51
• 3.2.2 培养条件对蔬菜芽胞杆菌GX01的生长影响51-53
• 3.2.3 营养成分对菌株GX01发酵降解AFB1的影响53-55
• 3.2.4 发酵条件对菌株GX01降解AFB1的影响55-58
• 3.2.5 响应面试验设计58-62
• 3.2.6 发酵液各组分对AFB1的降解62
• 3.2.7 加热、蛋白酶K对菌株GX01活性组分降解AFB1的影响62-63
• 3.2.8 粗酶液对AFB1的降解63
• 3.3 讨论63-65
• 3.4 小结65-66
• 结论66-67
• 参考文献67-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表文章75

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 尹少宇,王浩;农副产品中黄曲霉毒素的检测及控制[J];现代化农业;2000年05期

2 肖良,邢卫锋;黄曲霉毒素的危害与控制[J];世界农业;2003年03期

3 彭聪 ,梁学庆 ,林国剑;饲料中黄曲霉毒素的检测和脱毒研究现状[J];中国饲料;2003年20期

4 张平,张建勤,韩国;饲料中黄曲霉毒素污染的快速检测[J];现代化农业;2003年05期

5 彭聪,梁学庆,林国剑;饲料中黄曲霉毒素的检测和脱毒研究现状[J];河北畜牧兽医;2004年02期

6 陈建民,张雪辉;食品和饲料中黄曲霉毒素概述[J];粮食与油脂;2004年03期

7 周艺林;饲料中黄曲霉毒素对畜禽的危害及控制方法[J];贵州畜牧兽医;2004年02期

8 李洪,李爱军,董红芬,王满富;黄曲霉毒素的发生危害与防控方法[J];玉米科学;2004年S2期

9 李培武,马良,杨金娥,张文,杨春洪,杨湄;粮油产品黄曲霉毒素B_1检测技术研究进展[J];中国油料作物学报;2005年02期

10 栾丽杰;;黄曲霉毒素与食品安全[J];山东省农业管理干部学院学报;2005年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 孟庆利;;黄曲霉毒素的检测及控制[A];《2010中国猪业进展》论文集[C];2010年

2 张];曾庆孝;朱志伟;韩光赫;;黄曲霉毒素的快速检测方法[A];“科技创新与食品产业可持续发展”学术研讨会暨2008年广东省食品学会年会论文集[C];2008年

3 马静;朱惠莲;唐志红;凌文华;;尿粪黄曲霉毒素排泄及生物干预[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年

4 朱聪英;应永飞;韦敏珏;陈慧华;陆春波;周文海;林仙军;罗成江;;液相色谱-串联质谱法测定饲料中黄曲霉毒素的研究[A];中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议论文集[C];2012年

5 于建兴;沈洁;陆筑凤;李加友;;黄曲霉毒素研究进展[A];中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议论文集[C];2012年

6 朱聪英;应永飞;韦敏珏;陈慧华;陆春波;周文海;林仙军;罗成江;;液相色谱-串联质谱法测定饲料中黄曲霉毒素的研究[A];2013年饲料毒理学术报告会暨饲料毒理学专业委员会第五届全国代表大会材料集[C];2013年

7 计成;赵丽红;马秋刚;关舒;雷元培;;黄曲霉毒素生物降解的研究及前景展望[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（上册）[C];2009年

8 陈建民;张雪辉;杨美华;金钺;;中药中黄曲霉毒素检测概况[A];第八届全国中药和天然药物学术研讨会与第五届全国药用植物和植物药学学术研讨会论文集[C];2005年

9 尹淑涛;薛文通;张惠;;黄曲霉毒素检测方法研究进展[A];2007中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨中国中部地区农产品加工产学研研讨会论文集[C];2007年

10 徐日荣;唐兆秀;蓝新隆;;黄曲霉毒素研究进展[A];2008年福建省科协第八届学术年会农业分会场论文集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 瞿凌云 通讯员 张夏讯;武汉专家攻克黄曲霉毒素速测技术[N];长江日报;2005年

2 上海交通大学 徐建雄 教授;切莫小视饲料中黄曲霉毒素的危害[N];中国畜牧报;2003年

3 记者 刘志伟 通讯员 张夏讯;16分钟查出健康大敌黄曲霉毒素[N];科技日报;2005年

4 记者 祝文明;农产品黄曲霉毒素速测仪问世[N];中国食品质量报;2005年

5 国家质检总局标准法规中心 苏志明;警惕黄曲霉毒素的危害[N];中国国门时报;2006年

6 王宁　马秋刚 张建云 胡新旭 计成;黄曲霉毒素的传统去毒方法和生物降解研究进展[N];中国畜牧兽医报;2009年

7 林祥 梁斌 白艳青 崔顺花;黄曲霉毒素的污染与预防[N];中国畜牧水产报;2001年

8 农业部油料与制品质检中心项目主持人 李培武 研究员;农产品黄曲霉毒素亲和微球速测技术及速测仪诞生[N];中国畜牧兽医报;2005年

9 记者 高原;多吃青菜可减少黄曲霉毒素危害[N];新华每日电讯;2010年

10 ;牛奶里的黄曲霉毒素哪来的？[N];科技日报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 赖浩;黄曲霉毒素B1呼吸道暴露与肝癌发病关系的研究[D];广西医科大学;2015年

2 雷佳文;农产品中黄曲霉毒素新型免疫分析技术研究[D];中国农业科学院;2015年

3 鲍蕾;黄曲霉毒素的生物积累及其检测技术质量控制标准体系研究[D];中国海洋大学;2009年

4 张雪辉;中药中黄曲霉毒素检测方法研究及模式识别在中药领域中的应用[D];中国协和医科大学;2004年

5 王妍入;黄曲霉毒素替代物绿色免疫分析研究[D];中国农业科学院;2014年

6 丁小霞;中国产后花生黄曲霉毒素污染与风险评估方法研究[D];中国农业科学院;2011年

7 张道宏;黄曲霉毒素杂交瘤细胞株的选育及免疫层析检测技术研究[D];中国农业科学院;2011年

8 杨炼;抗黄曲霉毒素B_1的单链抗体的筛选、表达和改造[D];江南大学;2010年

9 樊彦红;黄曲霉毒素B_1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇对锦鲤及原代培养肝细胞的毒性研究[D];南京农业大学;2008年

10 王锋;黄曲霉毒素B_1的辐射降解机理及产物结构特性分析[D];中国农业科学院;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 许艳丽;产黄曲霉毒素菌株的检测方法及产毒条件的研究[D];中国海洋大学;2008年

2 张亮;T-2毒素与黄曲霉毒素特异性抗体的制备及应用[D];中国农业科学院;2015年

3 都晓慧;花生黄曲霉毒素风险评估抽样方法的研究[D];中国农业科学院;2015年

4 张盼;生物法降解黄曲霉毒素B1的初步研究[D];中国农业科学院;2015年

5 刘旭;粮食和食用油中黄曲霉毒素B_1高效低耗液相色谱检测方法的建立[D];西北农林科技大学;2015年

6 韩愈杰;黄曲霉拮抗菌株的分离筛选及对黄曲霉毒素的降解效果[D];河北农业大学;2015年

7 王文威;抑制黄曲霉毒素的深海细菌发酵及活性物质特性研究[D];哈尔滨工业大学;2015年

8 虞聪聪;淮河流域X县水体藻类及其毒素污染状况及微囊藻毒素LR与黄曲霉毒素B1的联合毒性作用研究[D];复旦大学;2014年

9 谢庆;吸附剂对肉鸭日粮中黄曲霉毒素吸附效果的研究[D];东北农业大学;2015年

10 张捷;牛奶及饲料中主要霉菌毒素对Caco-2细胞毒性作用的影响[D];甘肃农业大学;2015年

，

本文编号：808345