日本血吸虫钙网质蛋白免疫生物学功能的初步研究

发布时间：2017-09-08 04:49

  本文关键词：日本血吸虫钙网质蛋白免疫生物学功能的初步研究

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【摘要】：研究表明,辐照致弱血吸虫疫苗能够诱生高保护性免疫效果,其机制可能是通过辐照致弱血吸虫来源的分子刺激宿主免疫细胞在肺部形成了以Th1为主的致炎性环境而实现的。因此,发现和鉴定这些保护性分子并阐明其免疫生物学功能,对研发高效安全的抗血吸虫分子疫苗具有重要的指导意义。本文旨在研究日本血吸虫钙网质蛋白(SchistosomajaponicumCalreticulin,SjCRT)在先天性免疫应答和获得性免疫应答中的作用和功能,以期为阐明辐照致弱血吸虫疫苗的保护机制提供依据。1、SjCRT在不同期别正常及辐照致弱童虫上的表达。体外培养不同期别的辐照和正常童虫,用胰酶消化成单个细胞。流式细胞术检测结果显示,体外培养4 d时SjCRT在辐照组虫体细胞内的表达量明显高于正常组(P0.05);而7 d、10 d和14 d时,SjCRT在辐照组虫体细胞内的表达量明显低于正常组(P0.05)。RT-PCR检测SjCRT转录水平变化,发现辐照组在7 d显著高于正常组(P0.05),在10 d时两组无显著差异。初步推断在辐照早期4 d时SjCRT在虫体细胞内呈现高表达,随着体外培养时间推移,SjCRT释放到细胞外。2、SjCRT活化宿主巨噬细胞的初步研究。SjCRT与RAW264.7细胞共孵育72 h,通过MTT检测细胞增殖情况、Griess法检测胞外NO含量、RT-PCR法检测巨噬细胞上几种细胞因子和趋化因子转录水平的表达、ELISA检测胞外细胞因子、流式细胞术检测细胞表面分子。MTT结果显示,SjCRT能够显著促进巨噬细胞增殖(P0.05);RT-PCR结果显示SjCRT促进巨噬细胞上调表达COX-2、cPLA2、CCR7、TNF-α和IL-1βmRNA;Griess法结果提示,SjCRT能够促进巨噬细胞分泌NO(P0.01);ELISA结果表明SjCRT能够极其显著地促进巨噬细胞分泌TNF-α(P0.01);流式细胞术表明,未经处理的巨噬细胞能表达一定水平的CCR7,但SjCRT的刺激能使巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7的表达水平极显著地增加(P0.05)。提示SjCRT可以活化巨噬细胞。3、探究SjCRT活化宿主DC的机制。通过激光共聚焦和流式细胞术研究SjCRT与DC的结合情况、RT-PCR检测DC上几种细胞因子和趋化因子转录水平的表达情况、ELISA检测DC培养上清中细胞因子表达情况、流式细胞术检测DC表面CCR7和CXCR4表达情况、CFSE法检测CD4+T细胞增殖、ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子分泌情况。结果:SjCRT可以结合在DC表面,它能够与DC表面的CD91受体结合进而被介导内吞;RT-PCR结果显示与未刺激相比,SjCRT的刺激可以促进DC极其显著地上调TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、CXCL-2、CCR7和CXCR4这几种细胞因子和趋化因子的mRNA的表达(P0.01);SjCRT的刺激也能促进DC极其显著的表达并分泌TNF-α、IFN-γ和IL-4,并且差异极其显著(P0.01);流式结果显示SjCRT的刺激能使细胞表面趋化因子受体CCR7和CXCR4的表达水平极显著地增加(P0.01);CFSE法表明SjCRT刺激组有明显的增殖现象,增殖细胞百分比分别为47.7%和44.1%;ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子分泌情况,显示SjCRT刺激48h后的DC能够促进T细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10,并且与对照组相比差异极显著(P0.01)。结果提示:SjCRT能够促进DC功能成熟。4、SjCRT诱导致敏小鼠混合淋巴细胞反应。SjCRT刺激致敏小鼠淋巴细胞48 h后,MTT法检测淋巴细胞增殖、流式细胞术检测淋巴细胞亚群状况以及胞内细胞因子的表达情况。结果显示该蛋白能够显著地刺激致敏小鼠淋巴细胞增殖(SI2);蛋白免疫组CD4+/CD8+T细胞的比值为2.26显著高于对照组的1.76(P0.01),且胞内IFN-γ的表达量显著增加(P0.05)。提示SjCRT可以诱导小鼠产生Th1型免疫应答反应。综上所述,本研究发现SjCRT在辐照童虫早期能够大量表达并释放到细胞外。SjCRT可以活化巨噬细胞、通过CD91受体介导进入DC促进DC功能成熟并且能够活化CD4+T细胞并诱导其向Th1型分化。为DC进一步诱导抗原特异性的CD4+T细胞的分化(极化)提供了基础,也为为进一步阐明SjCRT在辐照致弱血吸虫疫苗模型中所发挥的作用和机制奠定了基础。
【关键词】：日本血吸虫 日本血吸虫钙网质蛋白 树突状细胞 巨噬细胞 CD4+T细胞
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.735
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 绪论13-18
• 1.1 血吸虫生物学及抗血吸虫疫苗研究概述13-14
• 1.2 树突状细胞(DC)功能及其作用机制概述14-16
• 1.3 钙网质蛋白研究概述16-18
• 第二章 SjCRT在不同期别正常及辐照致弱尾蚴/童虫细胞上的表达18-27
• 2.1 实验材料18-19
• 2.1.1 实验主要试剂及仪器18
• 2.1.2 实验动物18
• 2.1.3 主要溶液配制18-19
• 2.2 实验方法19-21
• 2.2.1 收集和培养不同期别正常及辐照致弱日本血吸虫童虫19
• 2.2.2 RT-PCR检测SjCRT在各期别正常及辐照致弱童虫转录水平的表达19-21
• 2.2.3 流式细胞术检测SjCRT在不同期别正常及辐照虫体细胞内的表达21
• 2.3 实验结果21-25
• 2.3.1 SjCRT在不同期别辐照及正常童虫转录水平的差异比较21-22
• 2.3.2 SjCRT在不同期别正常童虫及辐照致弱童虫虫体细胞内的表达情况22-25
• 2.4 讨论25-27
• 第三章 SjCRT活化宿主巨噬细胞的初步研究27-37
• 3.1 实验材料27
• 3.1.1 细胞27
• 3.1.2 实验主要试剂及仪器27
• 3.2 实验方法27-29
• 3.2.1 SjCRT蛋白促进巨噬细胞增殖的检测和观察27-28
• 3.2.2 Griess法检测SjCRT刺激巨噬细胞后NO的分泌情况28
• 3.2.3 RT-PCR法检测巨噬细胞上几种细胞因子和趋化因子转录水平的表达28-29
• 3.2.4 ELISA法检测巨噬细胞细胞因子分泌情况29
• 3.2.5 流式细胞术检测趋化因子受体CCR7在巨噬细胞上表达29
• 3.3 实验结果29-35
• 3.3.1 SjCRT蛋白促进巨噬细胞增殖的检测和观察29-31
• 3.3.2 SjCRT蛋白促进巨噬细胞释放NO31-32
• 3.3.3 SjCRT促进巨噬细胞上调表达COX-2、cPLA2、CCR7、TNF-α 和IL-1β mRNA32-34
• 3.3.4 SjCRT诱导巨噬细胞高表达细胞因子情况34
• 3.3.5 SjCRT促进趋化因子受体CCR7在巨噬细胞上表达34-35
• 3.4 讨论35-37
• 第四章 SjCRT活化DC促进研究DC功能成熟及机制的研究37-49
• 4.1 实验材料37-38
• 4.1.1 实验主要试剂及仪器37
• 4.1.2 实验动物37
• 4.1.3 实验主要试剂配制37-38
• 4.2 实验方法38-40
• 4.2.1 激光共聚焦观察SjCRT结合DC的过程38-39
• 4.2.2 流式细胞术检测DC吞噬SjCRT情况39
• 4.2.3 RT-PCR检测DC上几种细胞因子和趋化因子转录水平的表达情况39
• 4.2.4 ELISA检测DC培养上清中细胞因子表达情况39
• 4.2.5 流式细胞术检测DC表面CCR7和CXCR4表达情况39-40
• 4.2.6 CFSE法检测CD4+T细胞增殖40
• 4.2.7 ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子分泌情况40
• 4.3 实验结果40-47
• 4.3.1 激光共聚焦观察SjCRT结合DC的过程40-41
• 4.3.2 流式细胞术检测DC吞噬SjCRT情况41-42
• 4.3.3 RT-PCR检测DC上几种细胞因子和趋化因子转录水平的表达情况42-44
• 4.3.4 ELISA检测DC培养上清中细胞因子表达情况44-45
• 4.3.5 流式细胞术检测DC表面CCR7和CXCR4表达情况45-46
• 4.3.6 CFSE法检测CD4+T细胞增殖46-47
• 4.3.7 ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子分泌情况47
• 4.4 讨论47-49
• 第五章 SjCRT诱导致敏小鼠淋巴细胞反应的研究49-56
• 5.1 实验材料49
• 5.1.1 实验主要试剂及仪器49
• 5.1.2 实验动物49
• 5.2 实验方法49-51
• 5.2.1 MTT法检测SjCRT致敏小鼠脾脏混合淋巴细胞增殖49-50
• 5.2.2 流式细胞术检测SjCRT致敏小鼠脾脏淋巴细胞亚群50
• 5.2.3 流式细胞术进行混合淋巴细胞胞内细胞因子检测50-51
• 5.2.4 ELISA法检测脾脏混合淋巴细胞胞外细胞因子51
• 5.3 实验结果51-54
• 5.3.1 SjCRT促进脾脏混合淋巴细胞增殖51
• 5.3.2 SjCRT致敏小鼠脾脏淋巴细胞亚群的测定51-53
• 5.3.3 混合淋巴细胞胞内细胞因子检测53
• 5.3.4 ELISA法检测脾脏混合淋巴细胞胞外细胞因子53-54
• 5.4 讨论54-56
• 第六章 全文总结56-57
• 参考文献57-61
• 致谢61-62
• 作者简历62

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1 马丽贞;日本血吸虫钙网质蛋白免疫生物学功能的初步研究[D];中国农业科学院;2016年

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本文编号：811986