甲硫氨酸代谢通路对禽致病性大肠杆菌调控机制的研究

发布时间：2017-09-09 18:31

  本文关键词：甲硫氨酸代谢通路对禽致病性大肠杆菌调控机制的研究

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【摘要】：禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种禽类局部或全身性传染病,其广泛的耐药性和复杂的血清型,一直制约对该病的防控,并对全球的养禽业造成重大的经济损失。存在于革兰氏阴性和阳性细菌中的LuxS/AI-2型密度感应系统,可产生通用自诱导信号分子AI-2 (Autoinducer,AI-2)。AI-2可与细菌受体结合,进一步诱导胞内相关基因的表达,最终调节自身的生理特性。AI-2的产生涉及微生物甲硫氨酸代谢通路(Activated methionine cycle, AMC),细菌可采用pfs/luxS和sa hH两种AMC代谢通路,而不同的代谢通路对APEC的调控机制以及应用甲硫氨酸代谢通路防治APEC的方法仍有待研究。本研究通过在APEC中构建不同甲硫氨酸代谢通路,探讨APEC在采用不同的甲硫氨酸代谢通路下对其致病性的影响,为研究APEC的致病机理提供基础,其中阻断或者改变APEC甲硫氨酸代谢通路的方法对APEC的诊疗及防控技术具有重要的应用价值。一.甲硫氨酸代谢通路中IuxS、pfs和sahH基因的克隆、表达以及体外活性验证为了验证在禽致病性大肠杆菌DE17株中构建甲硫氨酸sahH代谢通路的可行性,本研究构建了原核表达载体pET28a-luxS, pET28a-pfs 以及ET28a-sahH;可溶性分析结果表明,重组蛋白Pfs, LuxS和SahH蛋白在大肠杆菌中均为可溶性表达。体外活性实验分析结果表明,重组蛋白LuxS和Pfs同时与SAH作用后可产生400μmol/L的同型半胱氨酸(Homocysteine, HCY),而在相同条件下SahH蛋白只能催化SAH产生47.3 μmol/L的HCY。本研究成功获得了具有生物催化活性的Pfs、LuxS和SahH蛋白,验证了在DE17内构建sahH循环途径的可行性,为后续研究AMC通路对APEC致病性的影响奠定基础。二.APEC中不同甲硫氨酸代谢通路的构建为了在APEC中构建不同的甲硫氨酸代谢通路,本研究成功构建阻断pfs/luxS代谢通路的DE17Δpfs。由于APEC不具备sahH代谢通路,本研究构建了铜绿假单胞菌sahH基因的回复性载体pSTV-sahH,并分别转化至DE17和DE17Δpfs中,分别得到存在pfs/luxS和sahl俩种AMC通路的互补株sahH-DE17和只存在sahH甲硫氨酸代谢通路的互补株sahH-DE17Δpfs。Real-time PCR检测结果表明,sahH基因在sahH-DE17和sahH-DE17Δpfs中成功转录。AI-2活性检测实验证实,DE17Δpfsfs和sahH-DE17Δpfs的生长过程中不产生AI-2。与野生株DE17相比,sahH-DE 17的AI-2的生成受到明显抑制,至第6小时最为显著。本研究成功在APEC野生株DE17和缺失株DE17△pfs中,构建了甲硫氨酸sahH代谢通路,为进一步开展利用阻断或者改变甲硫氨酸代谢通路调节APEC致病性的应用型研究提供基础。三.不同甲硫氨酸代谢通路对APEC致病性的影响为了研究不同甲硫氨酸代谢通路对APEC致病性的影响,本研究开展了如下生物学特性研究：1)生长曲线测定。sahH-DE 17的生长快于DE17,而DE17Δpfs和sahH-DE17Δpfs的生长特性无显著差异,但均比DE17显著缓慢。2)LD50测定。与野生株DE17 (LD50为1.24×103 CF U)相比, DE17Δpfs (LD50为8.06×105CFU)毒力降低650倍,sahH-DE17Δpfs (LD50为6.49×104 CFU)毒力降低52.3倍,而sahH-DE17 (LD50)为4.22×103 CFU)毒力无显著变化。3)体内分布测定。与野生株DE17(血液：2.1×106CFU/mL；肝脏：1.7×107 CFU/g;脾脏：2.3×108 CFU/g;肾脏：4. 1×108 CFU/g)相比,DE17Δpfs (血液：1.6×102 CFU/mL肝脏：7.5×102 CFU/g脾脏：1.1×104 CFU/g;肾脏：1.4×104 CFU/g)的载菌量显著降低(P0.001), sahH-DE17Δpfs (血液：2.7×104CFU/mL肝脏：2.8×10s CFU/g;脾脏：8.9×104 CFU/g;肾脏：9.6×105 CFU/g)的载菌量显著降低(P0.001)；而sahH-DE17仅在肝脏的载菌量比DE17显著降低(肝脏,P0.001),在其他脏器或血液内无明显差异。4)黏附与侵袭实验。与野生株DE17(黏附：1.1×107CFU/孔；侵袭：1.4×104 CFU/孔)相比,DE17Δpfs (黏附：6.9×106 CFU/孔；侵袭：7.6x103 CFU/孔)的黏附与侵袭能力显著降低(P0.01),而sahH-DE17(黏附：9.8×106 CFU/孔；侵袭：8.4×10a CFU/孔)黏附无显著差异,侵袭能力显著减弱(侵袭,P0.01)。上述结果表明,在APEC中阻(?)rpfs/luxS代谢通路可以导致其致病性的降低,而构建sahH甲硫氨酸代谢通路仅能部分恢复其受损功能。本研究证实了APEC的pfs/luxS甲硫氨酸代谢通路对其致病性具有重要的调控作用。通过阻断或者改变APEC甲硫氨酸代谢通路来降低致病性的方法,为基于甲硫氨酸代谢通路开展APEC的致病机制及防控技术研究提供了重要的应用基础。
【关键词】：禽致病性大肠杆菌 甲硫氨酸代谢通路 LuxS/AI-2型密度感应系统 sahH基因 pfs基因
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 符号说明9-11
• 第一章 文献综述11-18
• 1 禽致病性大肠杆菌的研究进展11-12
• 1.1 禽致病性大肠杆菌的流行病学11
• 1.2 禽致病性大肠杆菌的致病因子11-12
• 1.3 禽致病性大肠杆菌的防控措施12
• 2 细菌密度感应系统的研究进展12-18
• 2.1 密度感应系统与细菌感染13
• 2.2 LuxS/AI-2型密度感应系统13-14
• 2.3 AI-2的合成途径和结构特征14-15
• 2.4 甲硫氨酸代谢通路15-18
• 第二章 禽致病性大肠杆菌中不同甲硫氨酸代谢通路的体外活性验证18-29
• 1 材料18-20
• 1.1 菌株及质粒18
• 1.2 主要试剂18-19
• 1.3 培养基19-20
• 1.4 主要仪器20
• 2 方法20-23
• 2.1 PCR引物设计和产物回收20-21
• 2.2 pET28a-luxS,pET28a-pfs以及pET28a-sahH原核表达质粒的构建21-22
• 2.3 重组蛋白LuxS、Pfs和SahH诱导表达及SDS-PAGE分析22
• 2.4 重组蛋白LuxS、Pfs和SahH的纯化22
• 2.5 重组蛋白LuxS、Pfs与SahH的体外催化活性验证22-23
• 3 结果23-28
• 3.1 原核表达质粒pET28a-luxS,pET28a-pfs以及pET28a-sahH的构建23-25
• 3.2 重组菌BL21(pET28a-luxS),BL21(pET28a-pfs)和BL21(pET28a-sahH)的鉴定和测序25-26
• 3.3 重组菌BL21(pET28a-luxS),BL21(pET28a-pfs)和BL21(pET28a-sahH)诱导、表达和可溶性分析26-27
• 3.4 HCY测定标准曲线27
• 3.5 LuxS/Pfs和SahH的酶活测定结果27-28
• 4 讨论28-29
• 第三章 禽致病性大肠杆菌不同甲硫氨酸循环通路的构建29-43
• 1 材料29-30
• 1.1 主要菌株29
• 1.2 主要试剂29-30
• 1.3 培养基30
• 1.4 主要仪器30
• 2 方法30-37
• 2.1 禽致病性大肠杆菌DE17△pfs基因缺失株的构建30-33
• 2.2 APEC不同甲硫氨酸循环通路的构建33-36
• 2.3 AI-2的活性检测36-37
• 3 结果37-42
• 3.1 pfs基因打靶片段的构建37-38
• 3.2 pfs基因缺失鉴定38-39
• 3.3 回复载体pSTV28-sahH的构建39-40
• 3.4 sahH基因的转录水平检测结果40-41
• 3.5 AI-2的活性检测结果41-42
• 4 讨论42-43
• 第四章 不同甲硫氨酸代谢通路通路对禽致病性大肠杆菌致病性的影响43-53
• 1 材料44-45
• 1.1 主要菌株及细胞44
• 1.2 实验动物44
• 1.3 主要试剂和培养基44-45
• 1.4 主要仪器45
• 2 方法45-47
• 2.1 菌株的培养条件45
• 2.2 生长曲线测定45
• 2.3 半数致死量(LD_(50))测定45-46
• 2.4 体内分布实验46
• 2.5 黏附与侵袭实验46-47
• 3 结果47-51
• 3.1 生长曲线测定结果47-48
• 3.2 半数致死量测定结果48-49
• 3.3 体内分布结果49-50
• 3.4 黏附与侵袭结果50-51
• 4 讨论51-53
• 全文总结53-54
• 参考文献54-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间发表的学术论文64-65

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本文编号：822065