抗鸡传染性法氏囊病病毒抗体ELISA检测方法的建立及标准抗原、标准血清的研制

发布时间：2017-09-10 04:41

  本文关键词：抗鸡传染性法氏囊病病毒抗体ELISA检测方法的建立及标准抗原、标准血清的研制

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【摘要】：传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)感染引起的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害3-6周龄雏鸡及青年鸡,使鸡群发病、死亡,同时病毒侵害鸡法氏囊B淋巴细胞,导致机体免疫抑制,诱发鸡群疫苗免疫失败,并对其他疾病的易感性增加,出现继发感染或混合感染。因此,传染性法氏囊病被认为是目前严重危害养鸡业的重要传染病之一。本研究利用分子生物学技术成功获得了GST-VP2和GST-VP3的可溶性重组蛋白,并以此表达产物建立了检测IBDV抗体的ELISA方法；同时,应用IBDV-JS株感染SPF鸡,制备了IBDV抗原和阳性血清,并对抗原和抗体进行了一系列的鉴定和标定,获得了相关标准抗原和标准血清,为IBDV的诊断提供了有效的方法和材料。1.检测IBDV抗体ELISA方法的建立本研究根据IBDV-JS株的序列,分别设计了VP2和VP3基因的特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法对VP2和VP3基因的全长进行了扩增,然后将目的片段经双酶切克隆至表达载体pGEX-6p-1,并转化BL21(DE3)感受态细菌,挑取阳性细菌克隆送公司测序鉴定。测序正确的pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3经IPTG诱导表达后,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析诱导表达产物,结果发现当IPTG终浓度分别为0.75mM和0.25mM时,细菌裂解上清中GST-VP2(约80KDa)和GST-VP3(约52KDa)的表达量最高。蛋白免疫印迹试验(Western-Blot)结果显示GST-VP2和GST-VP3重组蛋白均与IBDV阳性血清反应,表明重组蛋白具有良好的抗原性。将纯化后的重组蛋白GST-VP2和GST-VP3分别作为包被抗原,建立检测IBDV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。通过实验条件的优化,确定VP2, VP3抗原最佳包被量分别为5μg/ml,0.625μg/ml,待检血清最佳稀释度为1：400,最佳孵育时间为30 min,酶标二抗最佳孵育时间为30min,底物最佳显色时间为15min。用建立的ELISA方法检测50份SPF鸡阴性血清,以确定阳性临界值：对基于VP2重组融合蛋白建立的ELISA方法,当OD6500.12时,判为阳性；对基于VP3重组融合蛋白建立的ELISA方法,当OD6500.136时,判为阳性。交叉反应性实验证明本研究建立的抗体ELISA检测方法仅与IBDV阳性血清反应,与IBV、ILTV、MDV、ALV、EDSV、AIV-H9、NDV、REV、GPV等阳性血清均不反应,特异性良好。该方法的批内和批间的变异系数均小于10%,说明该方法可行、重复性好。用已建立的2种IBDV抗体检测ELISA方法检测采集自江苏地区的77份鸡血清样品,并与IDEXX公司以及BioChek公司的IBDV抗体检测试剂盒检测进行比较。结果VP2蛋白建立的ELISA与两种商品化试剂盒的检测符合率分别达到94.8%和96.1%；VP3蛋白建立的ELISA与两种商品化试剂盒的检测符合率仅为58.44%和59.7%。比较结果表明,用VP2蛋白建立的ELISA方法更适用于临床样本的检测。2.鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原、标准血清的研制本研究使用IBDV-JS株经泄殖腔、点眼感染28日龄SPF鸡,无菌取病死鸡法氏囊组织进行研磨,通过离心和葡聚糖凝胶层析进行病毒纯化,对纯化的病毒抗原含量进行了标定。纯化后的病毒进行PCR鉴定、纯粹性鉴定、琼扩效价测定以及Western-blot分析,结果显示纯化后的IBDV不含IBV、ALV、REV、GPV、MDV、ILTV、AIV、NDV、EDSV等外源性病毒；琼扩效价为1：16；Western-blot试验结果显示纯化的病毒能与抗VP2蛋白的单抗反应。纯化的病毒经灭活后,分装冻干,检查冻干品物理性状,计算装量差异系数(CV),并进行支原体检验、无菌检验、灭活前后以及冻干前后琼扩效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出鸡传染性法氏囊病标准阳性抗原。以低剂量IBDV-JS株免疫接种14日龄SPF鸡,经过两次加强免疫后,再以强毒(经泄殖腔、点眼感染)攻击,攻击后12天,静脉试血,效价合格后心脏采血,分离血清,并对血清的特性进行测定。琼扩试验结果显示制备的多抗血清效价为1：128；Western-blot试验结果显示制备的多抗血清与IBDV-JS株、IBDV-Q株反应时均出现两条特异性条带,分子量分别约为30kD和65kD；试验结果显示制备的抗IBDV血清IFA效价为1：1600、ELISA效价为1：51200；免疫荧光试验(IFA)与血凝抑制试验(HI)证明该多抗血清与ALV、REV、MDV、EDSV、NDV、IBV、AIV等其他禽源病毒无交叉反应,特异性良好。对制备的阳性血清进行标定后,加入万分之一硫柳汞防腐剂,分装冻干,检查冻干品物理性状,计算装量差异系数值(CV),并进行支原体检验、无菌检验、防腐剂添加前后以及冻干前后琼扩效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出鸡传染性法氏囊病标准阳性血清。
【关键词】：鸡传染性法氏囊病病毒 VP2 VP3 抗原 血清 标准物质
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 符号说明11-13
• 文献综述 鸡传染性法氏囊病及其诊断技术的研究现状13-21
• 1. IBDV概述13-16
• 1.1 病原学13
• 1.2 血清学13
• 1.3 分子生物学13-16
• 1.3.1 IBDV基因组13-14
• 1.3.2 VP1蛋白14
• 1.3.3 VP2蛋白14-15
• 1.3.4 VP3蛋白15
• 1.3.5 VP4蛋白15-16
• 1.3.6 VP5蛋白16
• 2. IBD诊断技术的研究现状16-18
• 2.1 免疫学诊断方法16-17
• 2.1.1 琼脂扩散试验(AGP)16
• 2.1.2 免疫荧光技术(FAT)16
• 2.1.3 病毒中和试验(VNT)16-17
• 2.1.4 酶联免疫吸附实验(ELISA)17
• 2.2 分子生物学诊断方法17-18
• 2.2.1 聚合酶链式反应(PCR)技术17
• 2.2.2 限制性酶切片段长度多态性(RFLP)17-18
• 2.2.3 荧光定量PCR(real-time PCR)18
• 2.2.4 环介导等温扩增技术(LAMP)18
• 3. IBD诊断与生物标准物质18-21
• 3.1 生物标准物质的概念和发展现状18-19
• 3.2 兽用生物制品的意义和价值19-20
• 3.3 标准物质的制备要求20-21
• 研究一 鸡传染性法氏囊病病毒VP2和VP3蛋白的原核表达及抗体检测ELISA方法的建立21-48
• 1. 材料21-22
• 1.1 生物材料21
• 1.2 主要仪器21-22
• 1.3 试剂22
• 2. 方法22-28
• 2.1 引物的设计和目的片段的扩增22-23
• 2.1.1 引物的设计22
• 2.1.2 病毒基因组的提取和目的片段的扩增22-23
• 2.2 VP2与VP3原核表达载体的构建23-25
• 2.2.1 目的片段的回收23
• 2.2.2 表达载体和目的基因的酶切及回收23-24
• 2.2.3 表达载体和目的条带的连接24
• 2.2.4 感受态细胞的制备及连接产物的转化24-25
• 2.2.5 阳性细菌克隆的鉴定25
• 2.3 重组蛋白的诱导表达和鉴定25-26
• 2.3.1 重组蛋白的诱导表达25
• 2.3.2 表达条件的优化25
• 2.3.3 SDS-PAGE分析25
• 2.3.4 Western-blot分析25-26
• 2.4 重组蛋白的纯化26
• 2.4.1 重组蛋白的大量表达26
• 2.4.2 重组蛋白的纯化26
• 2.5 鸡传染性法氏囊病病毒抗体检测ELISA方法的建立26-28
• 2.5.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的优化26-27
• 2.5.2 待检血清最佳孵育时间的优化27
• 2.5.3 酶标二抗最佳孵育时间的优化27
• 2.5.4 底物最佳显色时间及终止液的优化27
• 2.5.5 抗体检测ELISA阳性临界值的确定27
• 2.5.6 ELISA交叉反应性的检验27
• 2.5.7 ELISA方法的批内重复性和批间重复性实验27
• 2.5.8 与商品化试剂盒的检测结果比较27-28
• 3. 结果28-45
• 3.1 IBDV VP2和IBDV VP3目的片段的扩增效果28
• 3.2 pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3原核表达载体的构建28-29
• 3.3 重组蛋白的诱导表达和鉴定29-32
• 3.3.1 重组蛋白的诱导表达29-30
• 3.3.2 表达条件的优化30-32
• 3.4 重组蛋白的纯化32-33
• 3.5 鸡传染性法氏囊病病毒抗体检测ELISA方法的建立33-45
• 3.5.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的优化33-35
• 3.5.2 待检血清最佳孵育时间的优化35-36
• 3.5.3 酶标二抗最佳孵育时间的优化36-37
• 3.5.4 底物最佳显色时间及终止液的优化37-39
• 3.5.5 抗体检测ELISA阳性临界值的确定39
• 3.5.6 ELISA交叉反应性的检验39-40
• 3.5.7 ELISA方法的批内重复性和批间重复性实验40-44
• 3.5.8 与商品化试剂盒的检测结果比较44-45
• 4. 小结与讨论45-48
• 研究二 鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原、标准血清的研制48-74
• 1. 材料48-49
• 1.1 生物材料48-49
• 1.2 主要仪器49
• 1.3 试剂49
• 2. 方法49-57
• 2.1 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备、纯化与灭活49-51
• 2.1.1 病毒扩增49
• 2.1.2 病毒纯化49-50
• 2.1.3 PCR鉴定50
• 2.1.4 病毒灭活条件的优化50-51
• 2.2 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的特性分析51
• 2.2.1 病毒抗原的纯粹性鉴定51
• 2.2.2 琼扩效价测定51
• 2.2.3 Western-blot分析51
• 2.3 鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原的标定51-52
• 2.3.1 Real-time PCR测定病毒含量51-52
• 2.3.2 灭活前后及冻干前后琼扩效价测定52
• 2.3.3 交叉反应性鉴定52
• 2.4 传染性法氏囊病病毒标准抗原的其他检验52-54
• 2.4.1 标准病毒抗原的分装52
• 2.4.2 物理性状的检查52-53
• 2.4.3 无菌检验53
• 2.4.4 支原体检验53
• 2.4.5 装量差异系数分析53
• 2.4.6 均一性53-54
• 2.4.7 冻融稳定性54
• 2.4.8 长期保存54
• 2.5 鸡传染性法氏囊病病毒多抗血清的制备54
• 2.6 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清的标定54-55
• 2.6.1 琼扩效价测定54
• 2.6.2 交叉反应性鉴定54-55
• 2.6.3 Western-blot分析55
• 2.6.4 IFA效价测定55
• 2.6.5 ELISA效价测定55
• 2.7 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清其他检验55-57
• 2.7.1 标准血清的分装55-56
• 2.7.2 物理性状的检查56
• 2.7.3 无菌检验56
• 2.7.4 支原体检验56
• 2.7.5 装量差异系数分析56-57
• 2.7.6 防腐剂前后及冻干前后效价测定57
• 2.7.7 均一性57
• 2.7.8 冻融稳定性57
• 2.7.9 长期保存57
• 3. 结果57-72
• 3.1 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备、纯化与灭活57-58
• 3.1.1 病毒纯化57-58
• 3.1.2 PCR鉴定58
• 3.1.3 病毒灭活条件的优化58
• 3.2 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的特性分析58-60
• 3.2.1 病毒纯粹性鉴定58-59
• 3.2.2 琼扩效价测定59-60
• 3.2.3 Western-blot分析60
• 3.3 鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原的标定60-62
• 3.3.1 Real-time PCR测定病毒含量60-62
• 3.3.2 灭活前后及冻干前后琼扩效价测定62
• 3.3.3 交叉反应性鉴定62
• 3.4 传染性法氏囊病病毒标准抗原的其他检验62-64
• 3.4.1 物理性状的检查62
• 3.4.2 无菌检验62-63
• 3.4.3 支原体检验63
• 3.4.4 装量差异系数分析63
• 3.4.5 均一性63-64
• 3.4.6 冻融稳定性64
• 3.4.7 长期保存64
• 3.5 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清的标定64-69
• 3.5.1 琼扩效价测定64-65
• 3.5.2 交叉反应性鉴定65-67
• 3.5.3 Western-blot分析67-68
• 3.5.4 IFA效价分析68-69
• 3.5.5 ELISA效价测定69
• 3.6 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清的其他检验69-72
• 3.6.1 物理性状的检查69
• 3.6.2 无菌检验69-70
• 3.6.3 支原体检验70
• 3.6.4 装量差异系数分析70
• 3.6.5 防腐剂添加前后及冻干前后效价测定70
• 3.6.6 均一性70-71
• 3.6.7 冻融稳定性71
• 3.6.8 长期保存71-72
• 4. 讨论与小结72-74
• 全文总结74-75
• 参考文献75-79
• 致谢79-80

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