猪瘟病毒蛋白对其3’UTR的调节作用

发布时间：2017-09-13 03:25

  本文关键词：猪瘟病毒蛋白对其3’UTR的调节作用

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【摘要】：猪瘟(Classical swine fever)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引发的一种疾病,具有高致病性和高传染性,可对猪类养殖业带来严重的经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病。猪瘟病毒是一种单股正链RNA病毒,其基因组包括一个开放阅读框(open reading frame,ORF),一个3’端非编码区(3’untranslated region,3’UTR)和一个5’端非编码区(5’untranslated region,5’UTR)。猪瘟病毒的开放阅读框编码一个由3898个氨基酸所组成的多聚蛋白,该多聚蛋白可在病毒自身蛋白酶和宿主细胞信号肽酶的水解和修饰作用下形成12个成熟的蛋白,包括C、Erns、E1、E2、Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。猪瘟病毒基因组的复制过程需要多种自身非结构蛋白的参与,研究表明NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B是猪瘟病毒RNA复制所必需的。猪瘟病毒3’UTR的二级结构包括4或5个茎环结构(stem loop,SL),对病毒RNA的复制和翻译有着重要作用。为了研究猪瘟病毒各个蛋白对其3’UTR在翻译水平的调节作用,本研究构建了猪瘟病毒各蛋白的真核表达载体和3’UTR的荧光素酶表达载体,并将各蛋白的真核表达载体分别与3’UTR的荧光素酶表达载体共转染至PK-15细胞,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析各蛋白对3’UTR的功能是否具有调节作用。结果显示猪瘟病毒C、NS4A、NS5A和NS5B蛋白对其3’UTR的功能具有显著的调节作用。其中C蛋白和NS5B蛋白可以显著降低3’UTR的翻译抑制功能,因此推测C蛋白和NS5B蛋白对病毒的翻译起到促进作用;而NS4A、NS5A蛋白可以促进3’UTR的翻译抑制功能,推测对病毒的翻译起到抑制作用。为了进一步研究猪瘟病毒C蛋白对其3’UTR在翻译水平的调节作用,首先研究C蛋白在3’UTR上的具体调节位点。通过构建3’UTR不同茎环区域调控下的荧光素酶表达载体,并与C蛋白的真核表达载体共转染后,发现C蛋白对其3’UTR的调节位点主要定位于3’UTR的1-139nt区(SL-1和SL-2)。同时也研究了猪瘟病毒C蛋白对3’UTR发挥调节作用的主要功能区域。利用生物信息学对C蛋白进行分析,发现59-69位氨基酸为C蛋白的氨基酸保守区,对该区域进行缺失突变后,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析,结果显示猪瘟病毒C蛋白的59-69位氨基酸对于C蛋白在3’UTR的调节过程中起到较为重要的作用。总之,本研究利用双荧光素酶报告基因检测系统发现猪瘟病毒C蛋白对其3’UTR在翻译水平的功能具有显著的抑制作用,推测对病毒的翻译可起到促进作用,且该调节作用主要定位于3’UTR的1-139nt(SL-1和SL-2)区域;C蛋白中的第59-69位氨基酸在此调节作用中发挥了较为重要的作用。
【关键词】：猪瘟 猪瘟病毒 3’端非编码区 C蛋白
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 背景介绍10-16
• 1 猪瘟（Classical swine fever）10
• 2 猪瘟病毒10-13
• 3 猪瘟病毒C蛋白的主要功能13-15
• 4 研究目的和意义15-16
• 第二部分 猪瘟病毒蛋白真核表达载体的构建及其表达检测16-48
• 1 材料16-23
• 1.1 载体、菌株和细胞系16
• 1.2 主要试剂16-17
• 1.3 溶液配制17-22
• 1.4 主要仪器设备22-23
• 2 方法23-41
• 2.1 引物的设计与合成23-24
• 2.2 重组质粒的构建与提取24-37
• 2.3 细胞的复苏与培养37-38
• 2.4 细胞的转染38-39
• 2.5 Western Blot39-41
• 3 结果41-47
• 3.1 猪瘟病毒蛋白真核表达载体的构建与鉴定41-46
• 3.2 猪瘟病毒蛋白的真核表达与检测46-47
• 4 结论47-48
• 第三部分 猪瘟病毒蛋白对其 3’UTR功能发挥的影响48-53
• 1 材料48
• 1.1 载体、质粒和细胞系48
• 1.2 主要试剂48
• 1.3 主要仪器设备48
• 2 方法48-49
• 2.1 细胞的复苏与培养48
• 2.2 细胞转染48-49
• 2.3 双荧光素酶相对活性的检测49
• 3 结果49-51
• 3.1 猪瘟病毒结构蛋白对其 3’UTR功能发挥的影响49-50
• 3.2 猪瘟病毒非结构蛋白对其 3’UTR功能发挥的影响50-51
• 4 讨论51-53
• 第四部分 猪瘟病毒C蛋白对其 3’UTR功能发挥的影响53-64
• 1 材料53
• 2 方法53-56
• 2.1 猪瘟病毒 3’UTR及C蛋白的结构及功能分析53-54
• 2.2 引物的设计与合成54
• 2.3 pCMV-C- deletion和pMIR105157重组质粒的构建与提取54-55
• 2.4 细胞的复苏与培养55-56
• 2.5 细胞转染56
• 2.6 western blot56
• 2.7 双荧光素酶活性检测56
• 3 结果56-62
• 3.1 猪瘟病毒 3’UTR SL-3 区域荧光素酶表达载体的构建与鉴定56-57
• 3.2 猪瘟病毒C蛋白突变载体的构建、表达与检测57
• 3.3 猪瘟病毒C蛋白对其 3’UTR功能的影响57-62
• 4 讨论62-64
• 参考文献64-68
• 附录68-75
• 致谢75

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本文编号：841237