副猪嗜血杆菌多位点序列分型及其密度感应信号分子初步鉴定

发布时间：2017-09-13 08:16

  本文关键词：副猪嗜血杆菌多位点序列分型及其密度感应信号分子初步鉴定

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【摘要】：副猪嗜血杆菌(HPS)是猪格拉泽氏病的病原菌,可以引起多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎,给猪群造成较高的发病率与死亡率。虽然目前血清分型鉴定了副猪嗜血杆菌的15个血清型,但仍然存在大量的不可分型菌株,这极大地限制了流行病学及种群结构分析,有必要通过MLST等基因分型方法对我国副猪嗜血杆菌进行分类。细菌生物被膜是造成副猪嗜血杆菌定植及耐药的主要原因,密度感应系统调控生物被膜的形成,可能与副猪嗜血杆菌的致病机制相关,而目前尚未有对于副猪嗜血杆菌密度感应系统的报道,故对副猪嗜血杆菌密度感应系统信号分子的研究有助于揭示该菌的致病机制。本研究对50株副猪嗜血杆菌田间分离株和15株参考株进行了MLST分型,共发现了26个新的等位基因序列和29个新的ST型,这极大地丰富了副猪嗜血杆菌MLST数据库。BURST分析表明副猪嗜血杆菌缺乏稳定的种群结构,具有较高异质性;ST型与地理位置之间也不存在关联。UPGMA系统发育树将所有的菌株分为两大组,A组和B组,存在于A组的菌株所属的血清型基本为无毒或弱毒,B组趋向于强毒菌株。利用密度感应系统Ⅰ型信号分子报告菌CV026和KYC55,对生物被膜形成能力较强的副猪嗜血杆菌田间分离株H19是否产生AHL类信号分子进行了定性检测,进而利用HPLC-MS-MS对副猪嗜血杆菌H19培养上清中存在的Ⅰ型信号分子进行鉴定,发现副猪嗜血杆菌所合成的Ⅰ型信号分子共有两种,其相对分子质量与C10-HSL和C12-HSL相同,但结构不同,由于确定其结构需要进行大量提取纯化,而H19产生的信号分子量极少,因此未能对其结构作进一步鉴定。儿茶酸具有抑制密度感应机制的作用,儿茶酸对副猪嗜血杆菌生物被膜形成的试验结果表明,儿茶酸使副猪嗜血杆菌H19生物被膜形成能力降低25.4%。利用自杀质粒pK18mobsacB通过同源重组方法,成功构建了副猪嗜血杆菌H19的ΔRbsB基因缺失突变株及其回复株,并进行了生物被膜形成能力检测,发现ΔRbsB基因缺失突变株生物被膜形成能力降低,而回复株生物被膜形成能力有所提升,初步确定RbsB基因与生物被膜形成有关。
【关键词】：副猪嗜血杆菌 生物被膜 多位点序列分型 密度感应系统 基因缺失
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 副猪嗜血杆菌研究进展11-13
• 1.1.1 副猪嗜血杆菌概述及生理生化特征11
• 1.1.2 副猪嗜血杆菌流行病学及分型11-13
• 1.1.3 突变株构建方法13
• 1.2 细菌生物被膜研究进展13-15
• 1.2.1 细菌生物被膜的特点14
• 1.2.2 细菌生物被膜的形成过程14
• 1.2.3 细菌生物被膜的耐药机制14
• 1.2.4 细菌生物被膜的致病机制14-15
• 1.3 密度感应系统研究进展15-18
• 1.3.1 细菌QS的种类及其信号分子15-17
• 1.3.2 QS系统信号分子的检测17
• 1.3.3 QS的应用17-18
• 1.4 本实验的研究目的及意义18-19
• 第二章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其MLST分型19-32
• 2.1 实验材料19
• 2.1.1 实验菌株及培养基19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 培养基的配制19
• 2.2 实验方法19-25
• 2.2.1 细菌菌株的培养19
• 2.2.2 革兰氏染色镜检19
• 2.2.3 细菌基因组的提取19-23
• 2.2.4 16S rRNA PCR扩增23
• 2.2.5 MLST分型23-25
• 2.3 实验结果25-30
• 2.3.1 革兰氏染色镜检25
• 2.3.2 16S rRNA PCR扩增25-26
• 2.3.3 MLST 7 个管家基因PCR扩增26
• 2.3.4 等位基因序列分析26-27
• 2.3.5 ST型分析27
• 2.3.6 多位点序列分型与血清型之间的关系27
• 2.3.7 BURST分析27-28
• 2.3.8 UPGMA聚类分析28-30
• 2.4 讨论30-32
• 第三章 副猪嗜血杆菌密度感应系统信号分子的检测与初步鉴定32-43
• 3.1 实验材料32
• 3.1.1 实验菌株32
• 3.1.2 培养基及液体试剂的制备32
• 3.1.3 主要试剂32
• 3.2 实验方法32-35
• 3.2.1 细菌菌株的培养32
• 3.2.2 H19（未加血清）生长曲线的测定32-33
• 3.2.3 H19生物被膜形成能力及周期检测33-34
• 3.2.4 密度感应信号分子的检测与鉴定34-35
• 3.2.5 儿茶酸对生物被膜形成的影响35
• 3.3 实验结果35-42
• 3.3.1 H19（未加血清）生长曲线35-36
• 3.3.2 H19细菌生物被膜检测结果36-37
• 3.3.3 密度感应信号分子的检测与初步鉴定37-41
• 3.3.4 儿茶酸对生物被膜形成的影响41-42
• 3.4 讨论42-43
• 第四章 副猪嗜血杆菌RBSB基因缺失突变株的构建43-55
• 4.1 实验材料43
• 4.1.1 实验菌株、质粒、培养基43
• 4.1.2 主要试剂43
• 4.2 实验方法43-50
• 4.2.1 菌株的培养条件43
• 4.2.2 细菌基因组的提取43
• 4.2.3 突变株的构建43-48
• 4.2.4 回补株的构建48-49
• 4.2.5 生物被膜形成能力检测49-50
• 4.3 实验结果50-53
• 4.3.1 pWLYR-1 质粒的构建及鉴定50
• 4.3.2 pWLYR-2 质粒的构建及鉴定50-51
• 4.3.3 ΔRbs B基因缺失株的鉴定51-52
• 4.3.4 pWLYR-3 质粒的构建及鉴定52
• 4.3.5 ΔRbs B基因缺失突变回复株的鉴定52-53
• 4.3.6 生物被膜形成能力检测结果53
• 4.4 讨论53-55
• 第五章 全文结论55-56
• 参考文献56-62
• 致谢62-63
• 作者简历63

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