羊痘病毒代谢组学研究及表达口蹄疫病毒抗原表位的活载体疫苗构建
发布时间：2017-09-15 21:35
本文关键词：羊痘病毒代谢组学研究及表达口蹄疫病毒抗原表位的活载体疫苗构建
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【摘要】：羊痘(Capripox,CP),是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)的绵羊痘病毒(sheeppox virus, SPPV)或山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,是惟一在细胞浆内复制的有囊膜的双股DNA病毒。羊痘给我国家畜生产和家畜产品带来严重的危害,造成巨大的经济损失,被OIE列为必须报告的动物疫病。口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的牛、羊和猪等重要经济畜种发病的重大动物疫病。FMDV不仅宿主广泛,传播速度快,而且血清型多,分别为O、A、C、Asial、 SAT1、SAT2和SAT3等七个血清型。本研究经过筛选和鉴定O型口蹄疫病毒的B细胞抗原表位,根据同源重组的原理,构建含有外源基因即抗原表位的表达盒,插入到含有胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因左右同源臂的载体中,构建病毒转移载体的质粒。转染到接种山羊痘病毒疫苗毒株的LT细胞中进行同源重组,筛选重组病毒。(1)口蹄疫O型Mya98毒株B细胞抗原表位的筛选与鉴定克隆了O型口蹄疫Mya98毒株的P1基因,运用：DNAstar软件对该病毒P1包含的4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)完整的氨基酸序列进行分析。分别按照Kyte-Doolittle方案、Karplus-Schulz方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案分析口蹄疫病毒结构蛋白P1的亲水性(Hydrophilicity)、可塑性(Flexibility)、抗原指数(Antigenic index)、和表面可及性(Surface probability),并综合以上指数最终得出P1结构蛋白上B细胞潜在的抗原表位是具有亲水性强,可塑性大的p转角或是无规则卷曲的部位,用Western blot和ELISA鉴定表位。(2)表达O型口蹄疫病毒抗原表位重组羊痘病毒的构建根据同源重组的原理,将启动子(P7.5/11)、报告基因(EGFP和GPT)、目的基因抗原表位(Epitope)、调控元件和终止子分别克隆连接到T载体,片段酶切后再用T4 DNA连接酶进行连接,构建基因表达盒;选择TK基因为外源基因的靶向位点,提取山羊痘病毒弱毒疫苗株(AV41)基因,克隆得到含TK基因ORF的两侧的同源臂,连接到T载体上；把含有各反应元件的表达盒插入到PGEM-TK中,构建出P7.5-EGFP-P11-GPT-Epitope的转移载体；转染到细胞里。(3)重组病毒的初步筛选对感染山羊痘病毒前、后的细胞进行代谢组学分析,为后续的重组病毒感染羊睾丸细胞的代谢组学分析、建立重组病毒的筛选方法提供依据。
【关键词】：口蹄疫病毒 山羊痘病毒 B细胞抗原表位 同源重组 代谢组学
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：
- 摘要6-7
- Abstract7-9
- 英文缩略表9-12
- 第一章 研究背景12-24
- 1.1 羊痘的流行病学12-13
- 1.1.1 羊痘病毒概况12
- 1.1.2 羊痘病毒的基因组12-13
- 1.1.3 羊痘病毒的流行特征13
- 1.2 口蹄疫病毒的研究进展13-14
- 1.2.1 口蹄疫病毒基因组的基本结构13
- 1.2.2 口蹄疫病毒主要的抗原位点13-14
- 1.3 同源重组介导的重组病毒研究进展14-21
- 1.3.1 表达盒的构建策略研究概述14-15
- 1.3.2 外源基因的靶向位点研究方法15-18
- 1.3.3 病毒同源重组的研究方法18
- 1.3.4 重组病毒的筛选研究进展18-19
- 1.3.5 疫苗研究中应用的活载体病毒19-21
- 1.4 代谢组学21-22
- 1.4.1 代谢组学的概念及发展22
- 1.4.2 代谢组学的应用研究22
- 1.5 本研究的目的和意义22-24
- 第二章 O型口蹄疫病毒抗原表位的筛选和鉴定24-30
- 2.1 试验材料24-25
- 2.1.1 病毒样品24
- 2.1.2 试剂及配制24-25
- 2.1.3 主要仪器设备25
- 2.2 试验方法25-27
- 2.2.1 引物的设计与合成25
- 2.2.2 FMDV基因组RNA的提取25
- 2.2.3 FMDV的RNA反转录25-26
- 2.2.4 多克隆抗体中IgG的纯化26
- 2.2.5 ELISA鉴定表位肽26
- 2.2.6 Western blot鉴定抗原表位26-27
- 2.3 结果27-28
- 2.3.1 抗原表位预测结果27
- 2.3.2 ELISA鉴定表位肽结果27-28
- 2.3.3 Western blot鉴定抗原表位结果28
- 2.4 讨论28-30
- 第三章 表达FMDV抗原表位重组羊痘病毒的构建及筛选30-36
- 3.1 试验材料30-31
- 3.1.1 病毒与细胞30
- 3.1.2 主要试剂及配制30-31
- 3.1.3 仪器与设备31
- 3.2 试验方法31-33
- 3.2.1 细胞的复苏31
- 3.2.2 细胞接毒、传代和收毒31
- 3.2.3 GTPV基因组DNA的提取31-32
- 3.2.4 GTPV复制非必需区的筛选32
- 3.2.5 构建病毒转移载体32
- 3.2.6 病毒蚀斑实验32-33
- 3.2.7 重组病毒的制备、纯化及鉴定33
- 3.3 结果33-35
- 3.3.1 病毒蚀斑实验结果33-34
- 3.3.2 荧光显微镜下重组病毒观察结果34
- 3.3.3 重组病毒PCR鉴定结果34-35
- 3.4 讨论35-36
- 第四章 细胞代谢组学分析36-41
- 4.1 试验材料36
- 4.1.1 病毒与细胞36
- 4.1.2 仪器与试剂36
- 4.2 试验方法36-37
- 4.2.1 代谢物萃取36
- 4.2.2 代谢物衍生化36-37
- 4.3 结果37-39
- 4.3.1 代谢组学分析37-39
- 4.4 讨论39-41
- 第五章 结论41-42
- 参考文献42-47
- 附录47-50
- 致谢50
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