鸡源产气荚膜梭菌多重PCR鉴定和药敏实验

发布时间：2017-09-17 18:06

  本文关键词：鸡源产气荚膜梭菌多重PCR鉴定和药敏实验

  更多相关文章： 产气荚膜梭菌 多重PCR 毒素型分型 抗药性 质粒提取

【摘要】：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是革兰氏阳性厌氧杆菌,普遍存在于环境以及人和动物胃肠道中,是人和动物胃肠道正常菌群,同时也是多种重要疾病的病原。产气荚膜梭菌能够产生至少17种外毒素和酶,这些毒素和酶与产气荚膜梭菌引起的各种疾病密切相关,可根据其中4种主要毒素的产生及基因携带状况将C.perfringens分为5个毒素型(A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι))。产气荚膜梭菌的毒素基因和抗药基因可随着质粒的转移,在同种细菌或不同种细菌之间穿梭,扩散细菌的毒素基因和抗药性基因。实验中比较分析3种不同的产气荚膜梭菌的质粒提取方法,并通过方法改进获得了有效的质粒提取方法,为进一步研究质粒抗药性基因奠定基础。为了解一些地区产气荚膜梭菌的毒素型分布情况及其抗药性情况,于2014年5月至2015年8月从广东新兴、开平、广西桂林、武鸣、玉林、云南石林,陆良、安宁地区,甘肃景泰,海南文昌、琼海地区共5省11个区县的养鸡场采集样品704个,分离产气荚膜梭菌菌株199株,分离率为28.5%,其中A型187株,C型12株。检测到NetB毒素基因阳性菌株6株,β2毒素基因阳性菌株54株。实验选取11种兽医常用抗生素进行产气荚膜梭菌的药物敏感性检测,根据MIC值判断产气荚膜梭菌对这些药物的敏感性,分析不同地区细菌的抗药谱以及抗药性程度。C.perfringens质粒的提取实验根据Mahony.et al(1986),Roberts.et al(1986)以及Hussain.et al(1993)的产气荚膜梭菌质粒提取方法进行质粒提取方法的优化,结果显示Mahony.et al(1986)的方法提取质粒效果不理想,几乎检测不到结果。Roberts(1986)的方法杂质较少但是质粒浓度很低,因此我们在Roberts(1986)方法的基础上同时吸取了Hussain.et al(1993)的质粒提取经验对实验方法进行改进,取得了较好的结果。提取结果条带清晰但浓度不满足测序条件,且容易降解。
【关键词】：产气荚膜梭菌 多重PCR 毒素型分型 抗药性 质粒提取
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 英文缩略表9-10
• 第一章 引言10-18
• 1.1 产气荚膜梭菌及其对家禽养殖业的危害10-15
• 1.1.1 产气荚膜梭菌10-11
• 1.1.2 产气荚膜梭菌的5种毒素型及引起的疾病11-13
• 1.1.3 产气荚膜梭菌引起的鸡的坏死性肠炎13-15
• 1.2 产气荚膜梭菌质粒研究进展15-18
• 1.2.1 产气荚膜梭菌毒素质粒研究进展15-16
• 1.2.2 产气荚膜梭菌抗药性质粒研究进展16-18
• 第二章 产气荚膜梭菌的分离纯化和毒素分型18-34
• 2.1 材料和主要仪器18-19
• 2.1.1 实验材料18-19
• 2.1.2 主要仪器19
• 2.2 方法19-24
• 2.2.1 样品采集19
• 2.2.2 细菌分离与纯化19
• 2.2.3 菌株保存19-20
• 2.2.4 细菌形态观察和生化鉴定20
• 2.2.5 分子生物学鉴定20-24
• 2.3 结果24-31
• 2.3.1 菌株分离24-25
• 2.3.2 形态学观察25-26
• 2.3.3 生理生化鉴定26
• 2.3.4 分子生物学鉴定结果26-31
• 2.4 讨论31-33
• 2.5 小结33-34
• 第三章 产气荚膜梭菌的药敏实验34-38
• 3.1 主要试剂和药物34
• 3.1.1 主要试剂及仪器34
• 3.1.2 主要药物及纯度34
• 3.2 实验方法34-35
• 3.2.1 药物溶液配制34-35
• 3.2.2 药敏实验方法35
• 3.3 药敏实验结果35-36
• 3.4 讨论与小结36-38
• 3.4.1 讨论36-37
• 3.4.2 小结37-38
• 第四章 产气荚膜梭菌质粒的提取38-42
• 4.1 材料38
• 4.1.1 材料和试剂38
• 4.1.2 主要仪器38
• 4.2 实验方法38-40
• 4.2.1 细菌的复苏38-39
• 4.2.2 产气荚膜梭菌质粒的提取39-40
• 4.2.2.1 方法一39
• 4.2.2.2 方法二39-40
• 4.2.3 琼脂糖凝胶电泳40
• 4.3 实验结果40
• 4.4 讨论和小结40-42
• 4.4.1 讨论40-41
• 4.4.2 小结41-42
• 第五章 全文结论42-43
• 参考文献43-48
• 致谢48-49
• 作者简介49

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