野鸽疱疹病毒的分离鉴定及UL27基因生物信息学分析

发布时间：2017-09-18 01:21

  本文关键词：野鸽疱疹病毒的分离鉴定及UL27基因生物信息学分析

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【摘要】：禽疱疹病毒感染广泛存在于多种鸟类之中,能引起鸡、鸭等禽类感染。目前,禽疱疹病毒的感染呈现多样化,不再局限于家禽体内,在鸽子体内也发现感染。自然感染野鸽临床表现为厌食、精神不振、结膜炎；剖检可见上呼吸道发炎,严重者溃疡,肝脏、脾脏、肾脏及胰脏坏死,肝脏表面可见小的坏死点；组织病理学检查显示肝细胞内可见核内包涵体,肝脏、肾脏、脾脏及胰脏大量坏死和炎症细胞浸润。鸽子是我国主要的经济动物之一,疱疹病毒对养鸽业造成较为严重的经济损失。鸽疱疹病毒(Pigeon herpesvirus, PiHV)又称哥伦比亚疱疹病I型(Columbid herpesvirus 1, CoHV-1),属于禽疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科马立克氏病毒属成员。该病首次爆发于1945年,目前已在世界范围内流行,成为危害养鸽业发展的主要传染病之一。2013年,康达畜禽咨询服务中心收到黑龙江省内的患病野鸽子病例。本研究通过对自然发病野鸽的流行病学调查、临床症状观察、以及病毒的分离纯化和理化特性检验、动物回归试验和基因检测分析证明该病病原为CoHV-1。这是我国首次在野鸽(Columba livia f. dom)中成功分离得到CoHV-1。UL27基因编码的gB蛋白是疱疹病毒感染过程中的主要囊膜糖蛋白。因此,研究鸽疱疹病毒UL27基因对其分子生物学功能意义重大,同时对临床上诊断、预防鸽疱疹病毒及其基因工程疫苗起着指导作用。本研究以CoHV-1-HLJ基因组为模板,设计简并引物,并结合步移PCR的技术,获得了CoHV-1-HLJ UL25、UL26、UL27基因序列,DNA序列分析得到的对应的开放阅读框(ORF)大小分别为1755bp、2328bp、2788bp；编码的氨基酸(aa)个数分别为584aa、775aa、995aa；UL27基因序列提交GenBank对应的登陆号为：KU051711。分析CoHV-1-HLJ gB蛋白抗原性,在gB蛋白胞外区抗原性较好的区域设计一对引物,克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-CoHV-gB,将阳性重组质粒转化到感受态BL21(DE3)中,得到大量的以包涵体形式表达的目的蛋白,SDS-PAGE可见蛋白大小约为37.5 kDa。重组蛋白能够与本实验室制备的兔抗CoHV-1-HLJ病毒粒子免疫血清发生特异性反应。综上所述,本研究为国内首次从野鸽(家养鸽子野外驯化)体内分离出一株鸽源疱疹病毒CoHV-1-HLJ, CoHV-1-HLJ感染鸽子后,临床上表现为呼吸抑制和结膜炎,解剖病理变化为肝脏、肾脏、脾脏及胰脏坏死及感染脏器内(肝脏)可见嗜酸性核内包涵体；pET28a-CoHV-gB是野鸽疱疹病毒UL27基因的主要抗原区域(231-510aa)。本实验的进行有助于了解目前中国CoHV-1-HLJ的分子流行情况,为今后CoHV-1-HLJ疫苗株的筛选及CoHV-1-HLJ的诊断防控提供了参考。
【关键词】：鸽疱疹病毒 核内包涵体 UL27基因 gB蛋白 主要抗原区域
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-20
• 1.1 疱疹病毒科概述10-16
• 1.1.1 疱疹病毒的分类10
• 1.1.2 疱疹病毒的形态结构10-11
• 1.1.3 疱疹病毒复制11-13
• 1.1.4 疱疹病毒的基因组结构13-14
• 1.1.5 疱疹病毒编码的蛋白14-15
• 1.1.6 实验室诊断技术15-16
• 1.2 禽疱疹病毒科概述16
• 1.3 疱疹病毒UL27基因及其编码的糖蛋白B的研究进展16-19
• 1.3.1 疱疹病毒UL27基因的特点及作用16-17
• 1.3.2 UL27基因编码的gB的结构特征17
• 1.3.3 gB的生物学特性及病毒感染中的作用机理17-18
• 1.3.4 gB蛋白在预防及诊断方面的研究18-19
• 1.4 研究的目的与意义19-20
• 2 研究的主要内容20-37
• 2.1 试验材料20-22
• 2.1.1 病料来源20
• 2.1.2 实验动物20
• 2.1.3 质粒及菌株20
• 2.1.4 引物20
• 2.1.5 主要试剂及抗体20-21
• 2.1.6 主要仪器21-22
• 2.2 野鸽疱疹病毒的分离鉴定22-27
• 2.2.1 临床病例的流行病学、临床症状及组织病理学观察22
• 2.2.2 细菌分离培养22
• 2.2.3 病毒分离培养22-23
• 2.2.4 血凝试验23
• 2.2.5 病毒鉴定23-24
• 2.2.6 PCR检测24-26
• 2.2.7 分离病毒的理化特性试验26-27
• 2.3 肉鸽回归试验27-28
• 2.4 鸽疱疹病毒UL27基因的克隆28-32
• 2.4.1 鸽疱疹病毒UL27基因保守序列的克隆28
• 2.4.2 鸽疱疹病毒UL27基因上游PUL28-UL27序列的克隆28-29
• 2.4.3 鸽疱疹病毒UL27基因下游UL27-PUL26序列的克隆29-31
• 2.4.4 鸽疱疹病毒UL27基因序列拼接31
• 2.4.5 鸽疱疹病毒UL27基因序列的校对31-32
• 2.5 鸽疱疹病毒UL27基因的序列分析32
• 2.6 鸽疱疹病毒UL27基因及其编码的gB蛋白的生物信息学分析32
• 2.6.1 UL27基因的核苷酸序列同源性分析32
• 2.6.2 UL27基因推导的氨基酸序列分析32
• 2.6.3 gB蛋白的结构预测32
• 2.6.4 gB蛋白的抗原性分析32
• 2.7 鸽疱疹病毒gB蛋白主要抗原区域的原核表达、纯化及抗体制备32-37
• 2.7.1 PCR扩增鸽疱疹病毒gB蛋白主要抗原区域及鉴定32-34
• 2.7.2 主要抗原域蛋白pET28a-CoHV-gB的表达34-35
• 2.7.3 主要抗原域蛋白pET28a-CoHV-gB包涵体纯化35
• 2.7.4 重组蛋白pET28a-CoHV-gB的复性35
• 2.7.5 兔抗CoHV-1-HLJ病毒粒子高免血清的制备35-36
• 2.7.6 主要抗原区域表达产物的Western-Blotting分析36-37
• 3 实验结果37-59
• 3.1 鸽疱疹病毒的分离鉴定结果37-40
• 3.1.1 临床病例的流行病学、临床症状及组织病理学观察结果37
• 3.1.2 细菌分离培养结果37-38
• 3.1.3 病毒分离培养结果38
• 3.1.4 血凝试验结果38
• 3.1.5 病毒电镜结果38-39
• 3.1.6 PCR检测及测序结果39
• 3.1.7 理化特性试验结果39-40
• 3.2 动物回归实验结果40
• 3.3 鸽疱疹病毒UL27基因保守序列的克隆结果40-44
• 3.3.1 鸽疱疹病毒UL27基因序列克隆技术路线及引物40-41
• 3.3.2 UL27基因保守序列的简并引物DP1和DP2设计41-42
• 3.3.3 UL27基因保守序列PCR扩增、纯化及重组质粒PCR鉴定结果42-43
• 3.3.4 UL27基因保守序列测定结果43-44
• 3.4 鸽疱疹病毒UL27基因上游PUL28-UL27序列的克隆结果44-46
• 3.4.1 UL28基因内简并引物DP3设计44
• 3.4.2 PUL28-UL27序列的PCR扩增、纯化及重组质粒PCR鉴定结果44-45
• 3.4.3 UL27基因上游PUL28-UL27序列测定结果45-46
• 3.5 鸽疱疹病毒UL27基因下游UL27-PUL26序列的克隆结果46-49
• 3.5.1 UL27基因下游UL27-PUL26序列的PCR扩增、纯化及重组质粒鉴定结果46-47
• 3.5.2 UL27基因下游UL27-PUL26序列测定结果47-49
• 3.6 鸽疱疹病毒UL27基因及其编码gB蛋白的生物信息学分析结果49-56
• 3.6.1 UL27基因序列校对后ORF预测结果49
• 3.6.2 UL27基因的核苷酸序列及其编码gB蛋白的氨基酸序列分析49-51
• 3.6.3 UL27基因的核苷酸序列同源性分析51-52
• 3.6.4 gB蛋白保守区分析结果52
• 3.6.5 gB蛋白氨基酸序列同源性分析52-53
• 3.6.6 gB蛋白氨基酸序列结构预测分析53-56
• 3.7 鸽疱疹病毒gB蛋白主要抗原区域的表达56-57
• 3.7.1 主要抗原区域的PCR扩增及表达载体的构建与鉴定56-57
• 3.7.2 重组蛋白的诱导表达57
• 3.8 兔抗CoHV-1-HLJ病毒粒子的多克隆抗体的效价测定57-58
• 3.9 重组蛋白pET28a-CoHV-gB表达产物的Western Blot鉴定58-59
• 4 讨论59-62
• 4.1 鸽疱疹病毒流行特点59
• 4.2 鸽疱疹病毒的UL27基因克隆59-60
• 4.3 鸽疱疹病毒的UL27基因及其编码的gB蛋白的分子特征60-62
• 结论62-63
• 参考文献63-72
• 附录72-76
• 攻读学位期间发表的学术论文76-78
• 致谢78-80

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